综述：为什么将肌球蛋白中的“快速反应巯基”标记会降低其产生的力量：重新审视我在加州大学旧金山分校的一年学习经历（1987-1988年）

《Biophysical Reviews》：Why labelling the ‘fast-reacting thiols’ of myosin reduces force output: re-assessing a year at the University of California San Francisco (1987-8)

肌球蛋白SH1螺旋的Cys707标记会干扰 relay 和 SH1螺旋的结构变化，从而抑制收缩力。结合近年预收缩和收缩后肌动蛋白-肌球蛋白结构解析，揭示了标记导致力输出的机制。

　　

摘要

在20世纪80年代，人们经常利用肌球蛋白SH1螺旋中的快速反应巯基来连接自旋或荧光探针，以检测肌球蛋白的定向。然而，我们发现使用碘乙酰乙酰氨基四甲基罗丹明（IATR）标记兔腓肠肌纤维中的这个残基（Cys707）会降低肌球蛋白在主动收缩过程中的力输出。现在，借助最新的肌动蛋白-肌球蛋白在动力冲程前后的结构数据，我们可以解释这些现象。我们将IATR模型应用于肌球蛋白5在动力冲程前后的相应SH1半胱氨酸残基上，结果发现标记这种快速反应的巯基会干扰产生动力冲程所需的中间结构和SH1螺旋的结构变化，从而解释了力输出减少的原因。

正如人们所熟知的，肌肉收缩是由分子马达肌球蛋白与肌动蛋白相互作用驱动的，这一过程由ATP水解提供能量。肌球蛋白组织成1.6微米长的粗纤维，与肌球蛋白结合蛋白C和肌联蛋白一起；肌动蛋白组织成约1.0微米长的细纤维，与原肌球蛋白和原肌球蛋白重链一起；在骨骼肌中还存在神经蛋白。这些纤维排列成重复单元（肌节），由Z盘边界分隔，Z盘的长度根据肌肉类型不同而有所差异。肌节沿着肌纤维的长度串联排列，每个肌节的微小缩短累积起来，最终在肌肉纤维末端产生较大的运动。我们现在已经了解了肌球蛋白在ATP酶循环不同状态下的许多结构细节，无论是与肌动蛋白结合还是分离的状态（参见Irving 2025；McMillan和Scarff 2022；Robert-Paganin等人 2020；Wang和Raunser 2023的研究）。我们还发现，在放松状态的肌肉中（高MgATP，低Ca²⁺），许多肌球蛋白头部以所谓的“相互作用头部”模式组织在一起，这一点最近通过冷冻电镜断层扫描得到了证实（Dutta等人 2023；Tamborrini等人 2023）。在这种状态下，两个头部相互作用，ATP的使用量较低，Roger Cooke首次将这种状态称为“超级放松”（SRX）状态（Stewart等人 2010）。

1987年，科学界还不知道肌球蛋白或肌动蛋白的原子结构。球状（G-）肌动蛋白的原子结构直到1990年才被确定（Kabsch等人 1990），肌球蛋白的结构则是在1993年（Rayment等人 1993）。为了理解肌球蛋白如何与肌动蛋白相互作用或改变其构象，人们采用了许多间接方法。当时，其中一位作者（Michelle）在伦敦国王学院MRC生物物理学部门作为研究员与Malcolm Irving合作，她使用了一种无需标记的技术——肌肉双折射法，该技术能够敏感地检测横桥的定向，来研究放松状态（+MgATP）和僵硬状态（-MgATP）肌肉中的横桥定向。通过这种方法，她发现放松状态下的肌球蛋白头部的长轴与纤维轴相对对齐，这与我们现在所知的放松状态下肌球蛋白的结构一致（Peckham和Irving 1989）。她在1986年的旧金山生物物理学会议上展示了这一研究成果；那是一场紧张的10分钟演讲，之后还有10分钟的问答环节。这些发现当时颇具争议，因为许多其他研究小组使用荧光或自旋标记物标记肌球蛋白SH1螺旋中的半胱氨酸残基来研究肌球蛋白的定向，他们发现肌球蛋白的定向是无序的（Thomas 1987；Thomas和Cooke 1980）。

随后Michelle前往加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）的心血管研究所（CVRI），在Manuel Morales的团队工作。她的项目是使用荧光偏振技术测量肌球蛋白横桥（肌球蛋白头部）在收缩过程中的定向变化，或者测量从笼养ATP中快速释放ATP的过程。在此之前，Morales团队已经使用反应性半胱氨酸残基进行荧光偏振测量（Burghardt等人 1984），但尚未测量过主动收缩过程。Michelle还研究了MgATP释放后使用笼养ATP激活肌肉纤维时双折射的变化（Peckham等人 1994）。Morales团队似乎很希望利用这种方法进行荧光偏振测量，但由于实验室没有所需的激光设备（当时是Candela公司的频率加倍染料激光器，输出320纳米的光脉冲，或者Xenon闪光灯），这一目标未能实现。不过Michelle开发了一种方法，在测量荧光偏振的同时测量单个肌肉纤维的力。

Michelle按照之前进行双折射实验的方式准备了去膜的兔腓肠肌纤维（Peckham等人 1994；Peckham和Irving 1989）。溶液的最终离子浓度为100 mM，并使用丙酸代替了氯化物，以避免在放松状态、僵硬状态和收缩状态之间切换时晶格间距的变化。纤维使用来自Molecular Probes公司（现隶属于ThermoFisher）的碘乙酰乙酰氨基四甲基罗丹明（IATR）进行标记。这种试剂主要标记骨骼肌球蛋白中的Cys707（也称为高反应性巯基SH1 1994），标记过程采用实验室的标准技术（Borejdo等人 1979）。纤维在放松溶液中用0到400 μM的IATR标记，然后洗涤以去除多余的标记物。接下来，纤维被转移到僵硬溶液（放松溶液，但不含MgATP）或激活溶液（放松溶液，但添加了Ca²⁺）中（Peckham等人 1990）。在测量力（图 1A）和荧光偏振后，一名能力出众的本科生（Katie）通过SDS凝胶电泳分析了纤维，并通过荧光成像确认肌球蛋白重链已被标记（图 1A）。

图1

测试IATR标记对力生成的影响。A 当溶液从放松状态变为激活状态时，用IATR标记的单一甘油化兔腓肠肌纤维产生了力。通过SDS PAGE分析样品并使用荧光确认主要是肌球蛋白重链（MHC）被标记。B 来自至少3个独立实验的结果，用于测试IATR标记对相对力输出的影响。每个数值都显示了平均值±标准差。曲线使用Prizm（GraphPad）软件拟合。

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从这些实验中，Michelle发现了两个现象：一是随着标记浓度的增加，产生的力减少（图 1B）；二是她没有检测到荧光偏振的任何显著变化。没有观察到荧光偏振变化的一个可能原因是市售的IATR含有两种异构体，尽管后续的研究似乎排除了这一可能性（Berger等人 1996）。然而，其他研究小组也观察到了对力的影响（Berger等人 1996）。但由于缺乏结构信息，她无法揭示这些现象背后的机制，因此这些数据从未发表。

现在，已经发布了大量关于肌球蛋白和肌动蛋白的结构数据。鉴于这种新的结构理解，我们能否理解为什么用IATR标记肌球蛋白会干扰力的生成？最近，使用肌球蛋白5a解析了肌球蛋白与肌动蛋白结合前的结构（Klebl等人 2025）。肌球蛋白5a在SH1螺旋中有一个丝氨酸残基而不是半胱氨酸残基（图 2A）。然而，将IATR模型应用于这一结构后发现，它位于中间螺旋和SH1螺旋之间，会抑制Pi释放后这些螺旋的关键结构变化（图 2B）。标记该区域的第二个半胱氨酸也可能产生干扰。因此，Michelle多年前的原始数据可能是正确的：用IATR标记会干扰力的生成。幸运的是，尽管她没有发表这些发现，但这种标记快速反应巯基的影响逐渐为科学界所认识，并且现在已经不再使用这种标记方法。

图2

A β-心脏肌球蛋白重链（β-MHC）、平滑肌肌球蛋白（SMM）、非肌肉肌球蛋白2A（NM2A）和肌球蛋白5a（Myo5a）的序列比对，显示了SH1螺旋中高反应性巯基的位置（在Myo5a中替换为丝氨酸），以及另一个也可以被标记的半胱氨酸残基SH2的位置，尽管SH1巯基的活性最高。B SH1巯基（C693）位于中间螺旋和SH1螺旋之间，用IATR标记这个残基可能会阻断动力冲程，同样标记SH2巯基（C684）也会产生干扰。

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Michelle是如何参与这些研究的呢？Michelle首次在1986年的旧金山生物物理学会议上遇到了Roger。Roger以其位于Parnassus Avenue上的漂亮住宅而闻名，距离UCSF很近。在她次年前往UCSF与Manuel Morales合作之前，她在1987年8月的Gordon会议上再次遇到了他。会议结束后Roger即将去度假两周，但他竟然把房子的钥匙交给了她，让她暂时住在那里，直到他自己找到住处。这只是他慷慨行为的一个例子。Roger之前还在Manuel Morales的实验室做过博士后，那时他已经有了自己的独立研究团队。他的团队中还有另一位英国博士后（Anthony Baker），他也帮助Michelle安顿下来。Roger和Michelle经常一起打网球，偶尔还会去跳舞（Marenge！）。当Michelle向他讲述实验室遇到的问题以及人们对她的发现的怀疑时，他给予了很大的支持。最终Michelle在1988年9月去了York大学David White的实验室工作，1990年开始在伦敦国王学院的生物物理学部门从事研究。

Roger是一位出色的朋友和同事，图中（图 3）他在Michelle的告别派对上。他在科学界做出了许多重要贡献，他在自己家举办的生物物理学派对也非常有名。Michelle非常感激他在旧金山期间的帮助和支持，以及之后的许多年里。

图3

Anthony Baker（左）和Roger Cooke（右）在1988年Michelle的告别派对上

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