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本研究旨在揭示青春期神经性厌食症(AN)患者外周血DNA甲基化特征，聚焦能量代谢与青春期延迟相关基因的表观调控。研究团队通过全基因组甲基化分析（Infinium MethylationEPIC BeadChip 850K芯片），在年轻女性AN患者中鉴定出87个差异甲基化区域和2,072个差异甲基化CpG位点，其中69%呈低甲基化。结果显示，MKRN3、LEPR等基因的甲基化异常与瘦素(leptin)、sirtuin信号通路和GnRH通路显著相关，为理解AN患者代谢障碍及青春期延迟的表观遗传机制提供了新依据。
青春期是人生理和心理发展的关键时期，但神经性厌食症(Anorexia Nervosa, AN)这一严重进食障碍常在此期间发生，严重影响少女的健康成长。患者因过度限制热量摄入导致严重营养不良，不仅影响身体发育，还常导致闭经和青春期延迟，其背后涉及复杂的代谢与内分泌失调。尽管遗传易感性是AN的重要因素，但环境压力（如极端节食）如何通过表观遗传机制影响疾病进程，尤其是在青春期这一敏感窗口期，此前尚缺乏深入探究。此外，既往DNA甲基化研究多集中在成年AN患者，年轻青春期患者的表观遗传特征是否与之相似，仍是一个待解之谜。为此，这项研究将目光聚焦于年轻女性青少年AN患者，探讨其全基因组DNA甲基化改变，特别关注与青春期及能量代谢相关基因的变化，以期为理解该疾病的发病机制和寻找潜在生物标志物提供新线索。相关成果发表在《Journal of Endocrinological Investigation》上。
为了回答上述问题，研究人员主要采用了以下技术方法：首先，收集了10名患有神经性厌食症及功能性低促性腺激素性性腺功能减退症的青春期女性患者和11名年龄匹配的健康青春期对照者的外周血样本。随后，提取其外周血白细胞DNA，并使用覆盖85万以上CpG位点的Infinium MethylationEPIC BeadChip (850K)微阵列芯片进行全基因组DNA甲基化分析。通过生物信息学方法鉴定差异甲基化区域(Differentially Methylated Regions, DMRs)和差异甲基化CpG位点(Differentially Methylated Positions, DMPs)，并进行功能注释。最后，利用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)软件对甲基化改变所涉及的生物学通路进行了富集分析。
研究结果
Population
对患者和健康对照组的临床及实验室特征进行比较发现，两组平均年龄和青春期分期相似。但AN患者组的体重指数标准差评分(BMI SDS)显著低于对照组(-1.71±0.71 vs 0.32±1.03; p < 0.001)。同时，AN患者的黄体生成素(LH)和17-β-雌二醇水平也显著降低，证实了功能性下丘脑性闭经的存在。
Psychological assessment
心理评估显示，大多数AN患者(75%)在儿童抑郁量表(Children’s Depression Inventory, CDI)上表现出临床显著抑郁症状，在儿童焦虑相关情绪障碍筛查(Screen for Child Anxiety Related Emotional Disorders, SCARED)量表中也显示出临床相关焦虑水平。儿童行为量表(Child Behaviour Checklist, CBCL)结果显示，患者在内在化及外在化问题得分上常处于临床范围。
Differentially methylated genomic regions in AN compared to healthy pubertal girls
甲基化分析共鉴定出87个DMRs，其中68.97%在AN组中呈现低甲基化。这些区域主要富集于免疫炎症通路基因（如LTA）、下丘脑摄食调节通路基因（如CLU）以及青春期启动相关基因（如MKRN3）。表观遗传景观的体外缺失分析(Landscape In Silico Deletion Analysis, LISA)还识别出多个关键的转录因子，包括孕激素受体(PR)、雌激素受体(ESR1)以及与DNA甲基化过程相关的DNMT1和DNMT3B。
Differences between groups at individual CpG sites
在个体CpG位点层面，研究发现了2072个DMPs，对应1896个基因。这些位点主要分布于基因间区和基因体，约27%位于启动子区域。整体分析显示，与DMRs趋势一致，AN组呈现广泛的低甲基化状态。这些差异甲基化CpG位点涉及与营养、代谢（如胆固醇/脂质处理的PRKAG2，葡萄糖代谢的IGF2R、RPTOR，食欲调节的GHRL、LEPR）、免疫功能（如NOD1、IRAK3、NR1H3）以及焦虑抑郁调控相关的基因。同时，也发现了与伤口愈合(TNXB)、骨骼稳态(LRP5)和能量代谢(FHL2)相关的位点存在甲基化差异。
DMPs related to puberty
研究鉴定出14个与初潮年龄相关的基因存在差异甲基化，包括GHR、LEPR、NFAT5、GAB2、DLK1等。转录因子分析共识别出180个转录因子，其中排名靠前的包括雄激素受体(AR)、雌激素受体(ESR1)、孕激素受体(PR)以及参与免疫和代谢调控的CEBPB。此外，在差异甲基化的启动子区域，富含雌激素反应元件(Estrogen Responsive Elements, EREs)的基因显著富集，提示雌激素信号通路的作用可能受到表观遗传机制调控。
Ingenuity pathways analysis (IPA)
通路分析(IPA)结果显示，差异甲基化基因显著富集于与卡路里限制、代谢和体重相关的信号通路，例如白色脂肪组织褐变(white adipose tissue browning)、sirtuin信号通路、胰岛素及瘦素信号通路。同时，也富集于与青春期发育相关的神经元信号通路，如促性腺激素释放激素(Gonadotropin-Releasing Hormone, GnRH)和semaphorin信号通路。雌激素和卵巢癌相关通路在两组间也呈现不同的甲基化状态。
ZNF methylation
甲基化谱分析鉴定出92个差异甲基化CpG位点映射在锌指蛋白(Zinc Finger, ZNF)基因附近。其中，ZNF148（调节GABA转运蛋白）、ZNF445和ZNF365（分别参与甲基化过程和基因组稳定性）在既往青春期疾病研究中也有报道。此外，ZNF574、ZNF30等基因与雌激素依赖性肿瘤相关；ZNF664、ZNF860、ZFAT等基因则分别与代谢综合征、低胆固醇血症、糖尿病以及脂肪细胞分化和体脂分布相关。
结论与讨论
本研究在青春期AN女性患者的外周血中发现了独特的、以低甲基化为主的DNA甲基化谱，这些变化影响了与能量稳态和青春期发育相关的基因。这些表观遗传改变可能代表了AN中代谢功能障碍和青春期延迟的生物标志物。研究结果不仅复制了既往在成年AN患者中发现的部分表观遗传特征（如代谢、免疫相关基因的改变），更重要的是，将研究视野扩展至青春期这一特殊发育窗口，并首次系统性地揭示了与青春期计时和生殖轴调控相关基因（特别是MKRN3、DLK1等）的表观遗传失调。
具体而言，MKRN3基因的低甲基化可能意味着其表观遗传抑制的解除，这或许与AN中观察到的下丘脑性低促性腺激素性性腺功能减退症有关。此外，DLK1、LEPR、GHR等青春期相关基因的甲基化改变，以及雌激素、GnRH等关键信号通路的富集，进一步支持了AN会破坏青春期正常发育所必需的精细激素平衡这一观点。
研究还发现大量锌指蛋白(ZNF)基因的甲基化发生改变。虽然ZNF基因与进食障碍的直接关联尚不明确，但其中许多基因参与代谢调节、对热量限制的反应以及基因组印记调控，暗示了它们在AN病理生理学中的潜在作用。例如，ZNF445和ZFP57是印记基因位点（如MEG3/DLK1）的调节因子，与青春期发育可能相关。
这些发现的意义在于，它们提示了在年轻AN患者中，严重的代谢压力和营养不良可能通过表观遗传机制，特别是DNA甲基化，影响调控青春期启动和能量平衡的关键基因，从而导致或加剧青春期延迟和闭经。研究观察到的大量低甲基化现象，也可能与长期禁食导致的甲基供体（如叶酸盐）缺乏有关。然而，由于本研究是横断面设计且样本量有限，无法确定这些表观遗传改变是疾病的原因、结果，还是对代谢压力的一种适应性反应。未来的纵向研究，特别是评估营养康复前后的甲基化动态变化，将有助于阐明这些表观遗传标记是否可逆，并评估其作为疾病监测生物标志物或治疗干预靶点的潜力。总的来说，这项工作为理解青春期神经性厌食症复杂的表观遗传机制提供了新的重要见解，并强调了在此关键发育阶段进行多组学研究的必要性。
