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本文系统评估了多种环境与管理因素（温度、湿度、生物膜成熟度、表面材质、机械擦洗及消毒剂类型）对不锈钢（SS）和热塑性聚氨酯（TPU）表面单/多物种生物膜内大肠杆菌（E. coli）O157:H7及腐败菌杀灭效果的影响。研究表明，消毒剂效力高度依赖于生物膜龄、机械擦洗与消毒剂类型的交互作用（p<0.01），其中专为清除生物膜设计的BioDestroy?效果最佳。ATP（三磷酸腺苷）生物发光检测证实，擦洗能显著降低有机残留。混合物种生物膜（含乳酸菌）结合擦洗，对O157:H7的清除效果最强。然而，成熟或干燥的生物膜、缺乏机械作用及过氧化氢处理等情况，仍可能导致病原体存活，凸显了生物膜的结构韧性与病原体对氧化应激的遗传耐受性。该研究为优化食品加工环境的卫生规程提供了关键数据支撑。
引言
在加拿大，每年约有474例食源性疾病病例与大肠杆菌（E. coli）O157:H7相关。作为一种产志贺毒素大肠杆菌（STEC），O157:H7是导致食源性疾病爆发和食品召回最常见的血清型，可引起包括血性腹泻和危及生命的溶血性尿毒综合征在内的严重疾病。食源性病原体可在食品加工设施中存活，若常规清洁消毒程序未能有效清除，它们可能在环境中持续存在。生物膜形成是细菌关键的生存策略，它能保护细菌抵抗抗生素、消毒剂和干燥等环境胁迫。先前研究表明，温度和湿度会影响多种表面（包括橡胶、玻璃、不锈钢和塑料）的生物膜形成。在食品工业中，由热塑性聚氨酯（TPU）制成的传送带和不锈钢（SS）表面是最常见的食品接触材料。研究表明，TPU可能比SS支持更多的细菌生物膜形成。因此，评估TPU（广泛用于牛肉加工）与不锈钢的差异，对于准确的风险评估至关重要。
方法
本研究使用了六种细菌菌株，包括一株强生物膜形成能力的O157:H7菌株（R508）、两种乳酸菌（LAB）和两种腐败菌（SP）组合。研究在TPU和SS试片（coupons）上形成单物种（仅O157:H7）和多物种生物膜。多物种生物膜包括三种组合：T1（中性）：Carnobacterium piscicola+ Lactobacillus bulgaricus+ O157:H7 R508；T2（协同）：Comamonas koreensis+ Raoultella terrigena+ O157:H7 R508；T3（拮抗）：Pseudomonas aeruginosa+ C. koreensis+ O157:H7 R508。生物膜在10°C或25°C下形成，并在湿态（相对湿度60–90%）和干态（相对湿度20–50%）条件下于10°C和25°C储存长达60天。随后，试片经过清洗（一组擦洗，一组不擦洗），然后暴露于六种消毒剂之一：季铵盐化合物（Quats）、次氯酸钠（Shypo）、氢氧化钠（SHyd）、过氧化氢（Hyp）、过氧乙酸（PeroA）或BioDestroy?。通过菌落计数评估杀菌效果，并使用ATP生物发光测试评估表面清洁度。
环境与程序性因素对大肠杆菌O157:H7减少量的影响
相关性分析显示，储存时间与菌落减少量呈最强的负相关（r = -0.537, p<0.01），表明生物膜越成熟，消毒剂效力越低。温度也与减少量呈负相关（r = -0.323, p<0.01），25°C下形成的生物膜比10°C下的更具耐受性。擦洗与不擦洗相比，与O157存活呈负相关（r = -0.146, p<0.01），表明机械擦洗能提高杀菌效果。试片材质呈现正相关（r = 0.264, p<0.01），消毒剂在不锈钢（SS）上的效果优于热塑性聚氨酯（TPU）。生物膜干湿条件和消毒剂类型本身未显示出显著相关性。主成分分析（PCA）进一步揭示，储存时间、温度、机械去除和表面材质是影响消毒剂效果的关键交互因素。
在相似复合条件下对单物种和腐败菌多物种生物膜的消毒剂效果比较
在选定的条件下（培养6天，10°C和25°C，SS和TPU表面，擦洗与不擦洗，干态与湿态），对所有消毒剂进行了比较。总体而言，消毒剂按效果从低到高排序为：过氧化氢 < 氢氧化钠 < Quats (GM) < Quats (PQ) < 次氯酸钠 < BioDestroy。湿态生物膜比干态生物膜表现出更高的耐受性。较高的温度（25°C）和TPU表面降低了消毒剂效力。机械擦洗显著增强了所有消毒剂的效果，特别是在不锈钢表面。
多物种生物膜组合
在所有测试的消毒剂中，BioDestroy（过氧乙酸） consistently是最有效的。对于含有乳酸菌（Carnobacterium和 Lactobacillus）的T1组合，湿态生物膜对所有消毒剂的反应均优于干态生物膜。值得注意的是，在25°C下于未擦洗的TPU表面形成的6天龄干态生物膜对大多数消毒剂具有极强的耐受性，只有BioDestroy能完全灭活O157:H7。对于含有腐败菌Comamonas和Raoultella的T2组合，消毒剂总体效果低于对乳酸菌的效果。过氧化氢和某些Quats在干态生物膜上效果较差，且TPU表面的生物膜比SS表面的更具抵抗力。对于含有Pseudomonas aeruginosa的T3组合，该菌表现出极强的耐受性，尤其是在10°C的湿态TPU生物膜中，成为最难控制的腐败菌。
ATP测试与大肠杆菌O157存活评估
ATP生物发光测试显示，擦洗能显著降低有机残留物，将未擦洗表面的相对光单位（RLU）值从>14,000降低至擦洗后的~100–180。在肉类加工业中，RLU值低于100通常被视为食品接触表面可接受的清洁度阈值。研究还通过富集培养评估了消毒处理后O157:H7的存活情况。结果表明，在特定不利条件下（如成熟干燥的生物膜、无机械擦洗、使用过氧化氢处理），即使平板计数无法检出，O157:H7仍可能存活，凸显了其顽强的生存能力。
结果与讨论总结
本研究表明，消毒剂对抗生物膜内病原体的效力受到多种环境和管理因素复杂交互作用的强烈影响。生物膜的成熟度（储存时间）、形成温度、表面材质（SS vs. TPU）以及是否进行机械擦洗是决定消毒成功与否的关键因素。在测试的消毒剂中，BioDestroy?（过氧乙酸）因其专为渗透和破坏生物膜基质而设计，表现出最优异的广谱杀菌效果。机械擦洗作为清洁程序的关键一环，能物理破坏生物膜结构，显著提高所有化学消毒剂的效力。研究还揭示了多物种生物膜中微生物相互作用的复杂性：某些乳酸菌组合可能增强对病原体的清除，而某些腐败菌（如Pseudomonas aeruginosa）则表现出极强的消毒剂抗性，可能为病原体提供庇护。此外，研究强调，基于浮游细菌敏感性的标准消毒剂浓度，可能不足以应对成熟生物膜的挑战。最后，在湿态或干态条件下储存60天后，未在TPU或SS上检测到O157:H7，但消毒处理后的存活评估表明，在不利条件下病原体仍可能以可复苏的状态存在，构成交叉污染风险。这些发现为食品加工设施制定更有效、更具针对性的卫生 protocols 提供了重要的科学依据，强调了结合机械清洁、选择合适的消毒剂并考虑环境条件对于控制生物膜相关病原体至关重要。
