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本文研究报道了一株源自吐哈盆地的链霉菌新种HMX112，该菌株能产生具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)活性的二硫吡咯酮类抗生素硫柳素。研究通过多相分类学鉴定确认为新物种，命名为Streptomyces flavimicrosus sp. nov.，并通过基因组分析揭示了其丰富的生物合成潜力及硫柳素的生物合成通路，为开发新型抗耐药菌药物提供了重要候选菌株和理论依据。
1. 菌株HMX112T的形态学与培养特征
菌株HMX112T在高氏一号培养基和酵母淀粉培养基上于30°C培养5天后，表现出不同的形态特征。在高氏一号培养基上，菌落形成黄色的基内菌丝和白色的气生菌丝。而在酵母淀粉培养基上，菌落呈粉红色，边缘呈丝状，这是放线菌的典型特征。扫描电子显微镜(SEM)进一步显示，气生菌丝丰富，生有长度不等的孢子链。孢子本身呈卵圆形，表面光滑无刺，孢子链排列成弯曲的环状结构。
2. 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析
菌株HMX112近乎完整的16S rRNA基因序列长度为1，525 bp。序列比对分析显示，HMX112属于链霉菌属(Streptomyces)，与Streptomyces lateritius CGMCC 4.1427T、Streptomyces narbonensis CGMCC 4.1737T以及Streptomyces purpureus DSM 43362T的序列相似性最高，分别为98.83%、98.83%和98.76%。根据链霉菌物种划分标准，16S rRNA基因序列相似性低于98.65%提示可能是一个新物种。通过邻接法构建的系统发育树显示，尽管HMX112与S. purpureus DSM 43362T、S. narbonensis CGMCC 4.1737T和S. lateritius CGMCC 4.1427T聚在一起，但它形成了一个独立的单系分支，这种明显的分离表明其与其它亲缘关系最近的物种存在显著的序列差异，足以支持HMX112作为新物种的地位。
3. 生理生化特征分析
生理学表征显示，菌株HMX112在25至37°C的温度范围内生长(最适25-30°C)，pH耐受范围为5-11(最适7-8)，可耐受高达5%的NaCl浓度。使用Biolog GEN III微孔板进行底物利用谱分析表明，该菌株可利用多种碳源和氮源。它能够水解明胶，对萘啶酸和氯化锂呈阳性反应，并表现出对氨曲南和溴酸钠的耐受性。值得注意的是，菌株HMX112对所测试的微生物具有抗菌活性。化学分类学分析进一步确认了HMX112属于链霉菌属。其细胞壁含有LL-二氨基庚二酸(LL-DAP)，全细胞水解物包含核糖和葡萄糖。主要的甲基萘醌是MK-9(H8)、MK-10(H4)和MK-9(H4)。极性脂质图谱包含二磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)以及几种未鉴定的脂质。主要的细胞脂肪酸是iso-C16:0、anteiso-C15:0和anteiso-C17:0。
4. 菌株HMX112T的全基因组测序
菌株HMX112T的完整基因组被测序和组装，显示为一个6，523，537 bp的环状染色体，GC含量为72.93%。为了明确其分类地位，计算了HMX112T与其三个亲缘关系最近的物种之间的平均核苷酸一致性(ANI)和数字DNA-DNA杂交(dDDH)值。这些ANI和dDDH值均显著低于物种界定的既定阈值。基于综合了独特的表型、生理、化学分类学及基因组特征的多相分类学方法，以及其产生荧光黄色抗菌化合物的独特能力，菌株HMX112T被提议为链霉菌属的一个新物种，命名为Streptomyces flavimicrosus sp. nov.。
5. 四个链霉菌物种的比较基因组分析
对Streptomyces flavimicrosus sp. nov. HMX112T及其三个亲缘关系密切的菌株进行了基于同源蛋白质编码基因的比较基因组分析。韦恩图显示四个菌株共享一个由3，386个直系同源基因簇组成的核心基因组。HMX112T拥有49个独特基因。尽管HMX112T的基因组总大小稍小，但其独特基因的比例相对较高，表明其可能编码了独特的代谢能力。全基因组共线性分析表明，HMX112T与S. purpureus DSM 43362T具有较高程度的共线性，而与S. narbonensis DSM 40016T相比则揭示了基因组重排或插入缺失。
6. 菌株HMX112T适应极端环境的基因组特征
使用eggNOG数据库对菌株HMX112T预测的蛋白质编码基因进行功能注释，显示出多样化的功能谱。在环境适应和应激反应方面，与信号转导机制和无机离子转运与代谢相关的基因丰度显著，这可能暗示了其适应盐碱条件和氧化应激的分子机制。与防御机制相关的基因可能涉及其对萘啶酸和氯化锂的耐受性。在次级代谢潜力方面，参与次级代谢物生物合成、转运和分解代谢的基因，包括非核糖体肽合成酶(NRPS)和聚酮合酶(PKS)，表明其具有产生抗菌或抗真菌化合物的能力。值得注意的是，最大比例的基因被注释为功能未知，这表明存在未表征的遗传决定因素，可能有助于其独特的生态适应或新颖的次级代谢途径。
7. 菌株HMX112T基因组中次级代谢产物生产的预测
使用综合抗生素研究数据库(CARD)分析菌株HMX112T的蛋白质序列，鉴定出四个抗生素抗性基因及其相关抗性机制。这些基因包括MexW(一种多重抗生素外排复合物的组分)、IleS(异亮氨酰-tRNA合成酶，通过靶点改变赋予莫匹罗星抗性)、IMP-51(一种金属-β-内酰胺酶变体)和MupB(另一种赋予莫匹罗星抗性的异亮氨酰-tRNA合成酶)。ileS和mupB基因的存在表明，该菌株可能产生莫匹罗星类似物或具有在莫匹罗星存在下存活的内在机制。因此，HMX112T是发现新型抗MRSA抗生素或独特生物活性代谢物的有希望的候选菌株。使用antiSMASH对HMX112T基因组进行挖掘，预测出31个生物合成基因簇(BGC)，涵盖了NRPS、PKS、萜类和核糖体合成并翻译后修饰的肽(RiPPs)等多种类型。值得注意的是，其中19个BGC与已知簇的相似性较低，表明其产生新型化学支架的潜力很高。
8. 菌株HMX112T活性天然产物的分离、鉴定及抗菌活性
对菌株HMX112T7天发酵液的粗乙酸乙酯提取物进行分馏，通过制备薄层色谱进一步纯化，得到目标亮黄色条带的纯化合物。该化合物在自然光下呈亮黄色絮状固体，在常见有机溶剂中溶解性差，在氯仿和丙酮中微溶，在DMSO中溶解度较高，在水中不溶。高分辨质谱(HRMS)显示[M+Na]+离子质荷比为250.9922，核磁共振碳谱数据支持其分子式为C8H8N2O2S2。通过对比文献数据和已知化合物特征，分离出的化合物被最终鉴定为硫柳素。
本研究系统评估了硫柳素的抗菌活性，证明了其广谱潜力。在针对常见病原菌的试验中，硫柳素对所有测试的七株革兰氏阳性和阴性细菌均表现出显著的抑制作用。值得注意的是，其对Staphylococcus pasteuri和Staphylococcus epidermidis的抑菌圈超过了阳性对照卡那霉素产生的抑菌圈。在针对多重耐药菌的评估中，硫柳素显示出对MRSA菌株的显著活性，最低抑菌浓度(MIC)值在8至16 μg/mL之间。此外，在50 ppm浓度下，硫柳素对包括Fusarium graminearum和Rhizoctonia solani在内的几种植物病原真菌实现了100%的抑制。其抗菌机制被认为涉及抑制细菌RNA聚合酶、破坏转录以及可能干扰真菌代谢途径或细胞壁合成。
9. 硫柳素生物合成机制分析
对Streptomyces flavimicrosus sp. nov. HMX112T的基因组分析发现，其簇24编码了一个预测含有吡咯酮环结构的产物，与硫柳素类化合物的核心支架高度相似。为了进一步探究硫柳素在HMX112T中的生物合成途径，将该簇与四个已知的负责生产硫柳素或其类似物的基因簇进行了比较。比较分析显示，所有四个簇的核心生物合成基因组织高度保守。基于这种高度保守性，簇24被初步鉴定为硫柳素生物合成基因簇，并命名为簇thi。
其中，非核糖体肽合成酶(NRPS， ThiB)是启动生物合成的中心催化单元。其腺苷化结构域特异性识别并激活两个半胱氨酸底物。肽基载体蛋白运输活化的中间体，缩合结构域催化肽键形成和环化，形成核心的二硫吡咯酮环支架。硫酯酶与NRPS紧密协作，水解成熟的环化中间体，将其从酶复合物中释放出来。乙酰转移酶是关键的后修饰酶，决定了结构的多样性；它可能利用不同的酰基辅酶A供体对环状支架的N7位进行酰化，从而产生硫柳素或结构类似物。二硫吡咯酮环内二硫桥的形成由簇内的氧化还原酶如黄素蛋白和其他氧化还原酶促进。
基于分析，提出了HMX112T中硫柳素的生物合成途径。该过程由NRPS启动，其活化并加载两个半胱氨酸分子。然后其缩合结构域催化肽键形成和环化，产生一个仍然通过硫酯键与NRPS相连的二肽衍生的杂环中间体。随后，硫酯酶水解该键，释放出环状支架。接着是氧化还原酶的作用，可能在其他辅助氧化还原酶的协助下，导致初步的二硫吡咯酮结构的形成。随后，该支架经历脱羧步骤。脱羧后的还原中间体被氧化，形成分子内二硫键。随后，甲基转移酶在N4位引入一个甲基，产生甲基化的holothin衍生物。最后，酰基转移酶利用丙酰辅酶A作为底物，催化N7位酰化，产生最终产物硫柳素，随后由转运蛋白将其输出细胞。
10. 讨论
本研究成功从极端沙漠环境吐哈盆地中鉴定出链霉菌新种Streptomyces flavimicrosus sp. nov. HMX112T。基于16S rRNA基因系统发育、基因组距离以及独特的生理和化学分类学特征，确认了其作为新物种的地位。菌株HMX112T对其严酷原生环境的适应策略似乎是基因组编码的。其对抗环境胁迫的能力与基因组中鉴定出的丰富的应激反应基因库相关。从菌株HMX112T中分离出的抗生素硫柳素显示出强效且广谱的抗菌活性。其抗革兰氏阳性菌的功效超过了传统抗生素卡那霉素。硫柳素对多重耐药的MRSA菌株也显示出有前景的活性。值得注意的是，在50 ppm浓度下，它对包括Fusarium graminearum和Rhizoctonia solani在内的几种关键植物病原真菌实现了100%抑制，突显了其在农业病害管理中的潜在效用。这种强大的生物活性可能是HMX112T在其贫瘠沙漠环境中的关键生态优势。硫柳素的主要抗菌机制涉及抑制细菌RNA聚合酶，从而阻断转录。基因组分析能够识别并功能注释了专用的硫柳素生物合成基因簇，这不仅从遗传学上证实了HMX112T的生产能力，而且为未来通过合成生物学方法进行产量优化和结构衍生化建立了一个基础平台。
11. 结论
本研究成功鉴定并表征了一株从吐哈盆地沙漠分离出的新细菌物种Streptomyces flavimicrosus sp. nov. HMX112T。通过全面分析，确认了其独特的分类地位，并证明了其产生抗菌化合物的能力。该菌株的基因组被发现包含众多生物合成基因簇，表明其产生多样化天然产物的巨大潜力。我们从该菌株中分离并鉴定出硫柳素作为关键的抗生素化合物。实验室测试证实，硫柳素能有效抑制多种病原菌(包括耐药的MRSA菌株)以及多种植物病原真菌的生长。此外，我们鉴定了HMX112T中负责硫柳素生物合成的完整基因簇，为其生产能力提供了遗传学证据。这些发现确立了S. flavimicrosus HMX112T作为抗生素发现的重要微生物资源。其新颖的分类地位、强大的抗菌活性以及特征明确的生物合成途径相结合，使得该菌株在针对抗生素耐药性挑战开发新型抗感染药物方面极具前景。
