《New Phytologist》：Role of extracellular carbonic anhydrase in the polar diatom Fragilariopsis cylindrus
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本期推荐一篇关于极地硅藻碳浓缩机制（CCM）的前沿研究。文章通过膜进样质谱（MIMS）和数学模型，首次定量揭示了胞外碳酸酐酶（eCA）在极地硅藻Fragilariopsis cylindrus碳固定中的核心作用，即通过一种新颖机制支持HCO3?跨膜运输，挑战了低温环境下CCM非必需的传统认知，对预测极地海洋初级生产力对环境变化的响应具有重要意义。
摘要
硅藻是极地高生产力海洋中的主要初级生产者，在寒冷水温和高CO2溶解度的条件下，它们是否依赖碳浓缩机制（CCM）来饱和光合作用尚存疑问。了解CCM的功能将有助于更好地预测极地海洋变暖和酸化对硅藻初级生产力的敏感性。本文以极地硅藻Fragilariopsis cylindrus为研究对象，通过膜进样质谱（MIMS）和数值模型对其CCM进行了表征。通过在数值模型中添加表面边界层，量化了胞外碳酸酐酶（eCA）的作用。
研究发现，F. cylindrus在无机碳可用性较宽的范围内均表现出活跃的CCM，但在空气平衡的CO2浓度下，CCM并非必需。eCA是CCM的关键组成部分，它促进了HCO3?的摄取。当eCA活性被抑制剂乙酰唑胺（AZ）抑制时，CO2成为主要的碳源。eCA在支持HCO3?摄取中的作用不受温度变化的影响。eCA支持的HCO3?转运机制，可能是F. cylindrus应对极地海洋动态季节循环中无机碳浓度波动的一种策略。此项工作挑战了CCM在低温下非必需的传统假说。
引言
海洋浮游植物的CO2浓缩机制涵盖了一系列将细胞内RuBisCO周围的CO2浓缩至近乎饱和光合作用的机制。CCM使浮游植物能够利用海水中的HCO3?大型储库，规避光合作用的CO2限制。尽管CCM的存在表明浮游植物的CO2固定对海洋酸化的直接影响（CO2增加和pH降低）敏感度较低，但研究发现其响应复杂，似乎具有物种和环境依赖性。
关于CCM是否在寒冷水域中起重要作用尚不确定。极地海洋占全球海洋的20%，其初级生产力支持着独特的生态系统，驱动着强大的生物碳泵。然而，实证研究表明，极地海洋的初级生产力速率似乎对海洋酸化的直接影响不敏感，这归因于海水中的CO2浓度已经较高，接近饱和光合作用，从而降低了对CCM的需求。
硅藻是极地海洋的主要初级生产者，迄今为止所有已知的硅藻都拥有CCM。探究海洋酸化对极地硅藻影响的研究结果不一。多项研究已经描述了硅藻中CCM的功能机制，似乎存在两种主要机制：一种是胞外碳酸酐酶在无机碳摄取中起关键作用，另一种是eCA缺失，无机碳摄取依赖于HCO3?转运蛋白。永久寒冷的极地水域中，低温会增加CO2溶解度、减慢扩散和化学反应速率、降低酶的半饱和常数并改变膜通透性。特别是，CO2和HCO3?之间的非催化平衡在低温下极慢，因此极地硅藻可能更依赖碳酸酐酶。
材料与方法
细胞培养条件
Fragilariopsis cylindrus CCMP1102细胞在含有25 mM HEPES缓冲液和补充了f/2营养盐的人工海水中培养，分别在3°C、-2°C或9°C的实验温度下维持。
膜进样质谱和气体浓度校准
使用膜进样质谱测量同位素标记的CO2和O2通量。每天进行校准，包括CO2浓度校准、O2信号影响的校正以及O2浓度的校准。
测量F. cylindrus细胞的CO2和O2信号
细胞洗涤后悬浮于DIC-free的人工海水中，暗适应后加入MIMS反应室。实验在有或无100 μM乙酰唑胺（AZ）的情况下进行，测量光照和黑暗周期内的气体浓度变化。光合作用速率和CCM功能参数主要从第二个光照期数据导出。
数据分析、建模和统计分析
使用定制Python脚本处理气体浓度随时间的变化。研究改编了前人提出的模型，纳入了呼吸作用并更新了适用于寒冷环境的参数。通过将eCA活性限制在表面边界层的“受限模型”来建模F. cylindrus的CCM。
结果
抑制F. cylindrus的eCA会降低其对无机碳的亲和力
在3°C下测量了极地硅藻F. cylindrus净O2释放随DIC和CO2变化的函数。结果表明，与对照组相比，存在eCA抑制剂AZ时，光合作用对DIC和CO2的半饱和常数更高。然而，在空气平衡海水无机碳浓度下，对照组和AZ处理组细胞的O2释放没有差异，表明在这些条件下，eCA并非饱和光合作用所必需。
MIMS测量以量化F. cylindrus的CCM
利用MIMS测量的O2和同位素CO2信号轨迹，结合已知的物理化学参数，建模估算了不同细胞区室间的无机碳通量。此方法调整了极地海洋温度和较小细胞尺寸的参数，并纳入了表面边界层以量化eCA活性。
MIMS测量的被动通量
利用F. cylindrus细胞在黑暗中的18O标记CO2轨迹来量化被动碳通量的物理化学参数，包括CO2和HCO3?的质量转移系数、胞外CA活性和细胞内/胞质CA活性。测量结果显示，F. cylindrus细胞对CO2的渗透性高于HCO3?。
测量eCA活性及存在eCA时的无机碳摄取
高细胞数量使得可以通过MIMS量化eCA催化的速率，并测量存在eCA时的CO2和HCO3?质量通量。研究采用两种模型估算eCA活性：一是假设eCA在整体环境中均匀作用的“非受限eCA模型”，二是将eCA限制在细胞表面边界层内的“受限eCA模型”。在饱和DIC条件下，两种模型均显示CO2摄取分数接近零或为负值，表明HCO3?是光合作用期间的主要无机碳来源。
抑制eCA将碳摄取从HCO3?切换到CO2
相比之下，当eCA被抑制时，在所有测试的DIC浓度下，CO2主要被用作碳源。这一趋势在所测试的温度下均保持一致。这些结果表明，活跃的eCA是细胞质膜高效摄取HCO3?所必需的。
尽管数据表明eCA在从整体环境供应CO2方面作用甚微，但它可能在回收从细胞质泄漏的CO2方面或在表面边界层加速HCO3?和CO2的相互转化以供应CO2方面起重要作用。计算得出的eCA催化CO2净形成通量与跨细胞质膜的碳摄取相比，eCA的CO2回收/供应作用是次要的。然而，eCA供应或回收的CO2占跨膜CO2总通量的比例与eCA活性呈正相关。
F. cylindrus的CCM建模
研究扩展了CCM模型，使用受限模型将eCA活性限制在表面边界层内。模型受MIMS测量的温度依赖性物理化学参数以及光合和呼吸速率约束。图6显示了在eCA活跃和不活跃情况下，F. cylindrus在2 mM DIC、pH 8.1介质中稳态净通量和细胞内浓度的模型输出。
在两种情况下，F. cylindrus CCM的驱动力是从胞质到叶绿体的HCO3?主动泵送。当eCA活跃时，由此产生的低胞质[HCO3?]通过细胞膜主动摄取HCO3?得到补充。然而，当eCA不活跃时，没有HCO3?跨细胞质膜运输，CO2向胞质的净扩散是进入细胞的主要碳源。从叶绿体和线粒体泄漏的CO2通过胞质中的iCA进行再循环。
研究还模拟了低[CO2]情景。在此情景下，具有活跃eCA的F. cylindrus能够将HCO3?转运到胞质中并维持较高的光合速率。相比之下，没有eCA时，有利于CO2扩散进入细胞的浓度梯度要求胞质[CO2]极低，这也导致胞质[HCO3?]低，最终限制了碳固定速率。这些模拟结果与实验中观察到的eCA抑制后细胞对无机碳的半饱和常数升高一致。
讨论
F. cylindrus因其在极地海水和海冰中的丰度而被用作极地硅藻的模式物种。之前的研究推测极地硅藻不需要CCM即可进行生产，且F. cylindrus主要使用CO2作为无机碳源。然而，有证据表明许多极地硅藻使用以HCO3?为主要无机碳源的CCM。本研究量化了F. cylindrus的CCM功能，并证明在空气平衡的极地海水DIC浓度下，eCA活性并非必需，但在低CO2和高pH条件下，eCA对于维持光合速率至关重要。此外，发现eCA的作用主要是促进HCO3?而非CO2进入细胞，尽管其确切机制尚待阐明。
在低温下，eCA通过克服CO2和HCO3?之间非催化转化极慢的问题发挥重要作用。研究表明，F. cylindrus仅在低CO2浓度下才需要eCA来维持光合速率，这一现象在温带硅藻物种中也曾观察到。这些温带硅藻研究提出，eCA的作用是促进CO2跨细胞质膜的供应和/或在低CO2高pH条件下促进CO2的再循环。然而，本研究的模型和曲线拟合方法能够解析eCA活跃时F. cylindrus的无机碳利用。数据表明，当eCA活跃时，F. cylindrus主要利用HCO3?；相比之下，当eCA被抑制时，F. cylindrus的光合作用主要依赖CO2扩散。
研究认为，eCA是促进HCO3?跨细胞质膜转运所必需的。通过模拟一个依赖CO2扩散并具有活性eCA但没有胞质HCO3?摄取的替代CCM模型，发现该模型无法复制MIMS观测到的光合作用期间CO2浓度变化最小的现象。因此，研究提出F. cylindrus使用了一种依赖eCA的HCO3?转运系统。这种eCA支持的HCO3?转运可能是F. cylindrus应对极地海洋和海冰生境中CO2条件波动的机制。与季节变化相比，海洋酸化引起的pH变化可能较小，这表明极地硅藻的碳固定对海洋酸化具有稳健性。
致谢
作者感谢B. Hopkinson在MIMS实验和数学模型方面的广泛建议与培训，感谢Murray Badger在调整模型以测量存在eCA时的无机碳种类方面的有益讨论。该研究得到了Simons基金会、Sloan基金会和NSF的资助支持。
利益冲突
作者声明无利益冲突。
数据可用性
用于数据分析和CCM建模的Python脚本可在GitHub上获取。
