引言
炎症是生物体对抗不利环境因素的适应性反应，旨在恢复组织和器官功能。除了由机械化学损伤、微生物感染以及细胞代谢产生的高水平自由基诱导氧化应激引发的原发性炎症外，也可能发生慢性炎症过程（图1）。这种状态是基础稳态和慢性炎症之间过渡的原因，通常由长期暴露于内源性或代谢应激条件（如衰老、肥胖或细胞碎片等）所触发。副炎症综合征用于在应激下维持组织功能，指的是基础稳态和慢性炎症之间出现的低级别、适应性免疫反应，是对持续性内源性应激源的反应。持续激活可导致慢性病理结果，这由多种易位因子（包括核因子κβ (NF-κβ)、诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 或环氧合酶-2 (COX-2) 等）的激活所控制。这些分子通过改变白介素环境刺激免疫细胞的募集和自身反应性，从而延续这些病理生理状况。
在影响炎症进程的环境因素中，饮食提供的生物分子可能潜在地与免疫细胞受体相互作用，或阻止促炎介质的转录。除了营养素，植物性食物中的其他生物活性化合物（称为植物化学物质）可以抵御炎症。在这方面，西兰花（Brassica oleracea var. italica）因其营养和植物化学物质的丰富性而受到认可。西兰花中描述的生物活性化合物已被证明是有效的炎症调节剂，支持了调整饮食模式的理性医学建议。然而，尽管有证据，西兰花植物化学物质在预防氧化应激和炎症之间循环过渡方面的效率需要进一步证明（图1）。
考虑到西兰花中存在的植物化学化合物，特别是对炎症有活性的，硫代葡萄糖酸盐（GSL）由一个β-d-硫代葡萄糖与一个磺化肟部分和一个源自前体氨基酸的可变侧链（R）构成。GSL的生物活性源于它们通过β-硫代葡萄糖苷酶催化的水解酶促转化为生物活性衍生物（例如异硫氰酸酯 (ITCs)）。在ITCs中，萝卜硫素（SFN）在与炎症介质反应性方面是研究最深入的。因此，其解决与这一过程相关的分子级联反应的能力已得到广泛证明。因此，基于西兰花的材料已被建议作为抗炎功能成分，为副产物的增值提供了机会。因此，在评估酶水解之外这些材料的当前替代方案时，应注意胃肠道消化过程中生物活性ITC的释放取决于特定的物理化学环境和酶活性。因此，从功能上探索ITCs的生物可利用性（即胃肠道消化过程中从食物基质释放并可用于吸收的生物活性化合物比例）对抵抗副炎症的作用，可以为加强这些材料的可持续增值替代方案提供证据。
基于这些背景，本研究旨在阐明西兰花茎秆中生物可利用的ITCs（以SFN为代表）如何有助于降低副炎症综合征介质（COX-2，以及与氧化应激相关的类二十烷酸 (8-iso-PGF2α) 和炎症相关的类二十烷酸 (PGF2α和 PGE2)）的产生。通过评估SFN剂量依赖性地调节COX-2水平和相关类二十烷酸的能力，在模型系统中进一步证实了其预防副炎症的能力，从而突出了其调节关键促炎脂质介质的潜力。
结果与讨论
西兰花茎秆中硫代葡萄糖酸盐和异硫氰酸酯的生物可利用性
通过体外模型评估了稳定化西兰花茎秆材料预防肠道上皮副炎症综合征的能力。根据文献描述，西兰花茎秆经过最小化加工和最佳脱水条件预处理，以最大化胃肠道消化后肠道管腔中生物可利用的ITC和吲哚浓度。应用这种加工条件得到的西兰花材料中，硫代葡萄糖酸盐（包括glucoiberin (GI)、glucoraphanin (GR)、hydroxy-glucobrassicin (HGB)、glucoerucin (GE)、glucobrassicin (GB)、gluconasturtiin (PE)、methoxy-glucobrassicin (MGB) 和 neo-glucobrassicin (NGB)）的浓度递减顺序为：GR (2423.2 mg/kg dw) > GI 和 MGB (平均458.9 mg/kg dw) > GE (235.8 mg/kg dw) > GB、HGB 和 NGB (平均106.1 mg/kg dw)。正如预期，最成熟的ITC（SFN）的前体GR最为丰富，解释了生物可利用的GSL衍生物中SFN占主导地位的情况。同样，记录的GE高浓度也至关重要，因为该GSL被水解为erucin，然后进一步转化为SFN，从而大大促进了西兰花茎秆材料的抗炎能力。
为了确认SFN在生物可利用部分的主导地位，从而确定西兰花茎秆粉在口服摄入后预防氧化条件下继发性副炎症的实际能力，将获得的材料暴露于静态体外模拟胃肠道消化，该模拟模拟消化生理（机械、热、化学和酶）条件。生物可利用部分的定量分析证实，植物材料中的GSL水平在胃肠道消化期间降至检测限以下。这些发现与先前关于此类硫化合物在胃肠道消化期间对物理化学环境的稳定性的描述一致，允许ITCs和吲哚释放到肠道管腔中。或者，在监测的一系列ITCs和吲哚（SFN、erucin、iberin、indole-3-carbinol和3,4-diindolylmethane）中，平均而言，消化过程产生了4.32 mg/kg dw（生物可利用部分为0.072 μg/mL）的SFN，这是消化后可定量水平的唯一GSL衍生品。这一结果与西兰花茎秆中SFN前体（GR和GE，可氧化为SFN，尤其在酸性条件下）的主导地位相符，这些前体在胃肠道消化过程中通过转化途径GR > SFN和GE > E > SFN产生SFN。考虑到植物材料中GR、GE和SFN的浓度，生物可利用部分中SFN的量似乎有限。然而，消化过程中的物理化学条件和酶活性不仅将GSL转化为ITC和腈衍生物，还降解新形成的化合物。这一事实进一步支持了SFN在消化过程中对酶降解的稳定性，其回收率在37%至64%之间，远高于其他ITCs或吲哚报告的值。
由于SFN具有生物活性，其在肠道管腔中的浓度可用于细胞摄取，从而可能有助于前沿性地预防与炎症相关疾病相关的分子通路。基于此证据，SFN已被证明的抗炎能力为肠道上皮提供了宝贵的保护，从而减弱了相关的自身反应性免疫反应。然而，据我们所知，SFN在生物可利用浓度下的生物活性仍未得到证实。为此，本研究评估了西兰花茎秆胃肠道消化后提供的生物可利用SFN部分预防氧化应激触发的副炎症的能力。为此，评估了西兰花茎秆消化产物降低COX-2表达的能力。这是一种可诱导的环氧合酶亚型，在炎症和氧化刺激下产生，催化生物活性脂质的合成，即前列腺素类 (PGF2α和 PGE2α) 和异前列腺素 (8-iso-PGF2α)。为了进一步证明SFN的抗炎能力，超越生物可利用部分中不可避免地存在的额外植物化学物质的贡献，使用了模型系统来确认单独SFN在从西兰花茎秆生物可利用部分记录的浓度开始的递减浓度范围内的能力。
生物可利用性和纯萝卜硫素对COX-2的调节
为了阐明生物可利用的SFN阻断副炎症相关的生物活性脂质合成所代表的分子机制的能力，监测了负责催化类二十烷酸合成第一步的COX-2酶表达的变化。作为补充，还测定了被认为是氧化应激（8-iso-PGF2α）和炎症（PGF2α和PGE2）标志物的生物活性脂质水平。PGE2和PGF2α是与炎症病理生理学和免疫系统调节密切相关的典型COX-2衍生介质，而8-iso-PGF2α是一种非酶促F2-异前列腺素，被广泛认为是人类和实验模型中脂质过氧化和氧化应激的金标准标志物。这些类二十烷酸共同提供了生物可利用SFN靶向的副炎症反应组成部分的综合结果。
带着这个目标，基于饮食或保健品摄入的生物活性化合物的生物可利用部分活性，选择肠道上皮（Caco-2细胞）的氧化应激体外模型进行这些测定。
体外纤毛状肠道上皮单层暴露于促氧化刺激（50 μM H2O2）以诱导副炎症表型和相关信号通路，其中央事件是COX-2表达的上调。在促氧化条件下监测COX-2水平1小时，这提供了最高的酶表达。
在缺乏生物活性化合物（阳性对照）的情况下暴露于促氧化环境的肠道上皮细胞显著增加了COX-2水平（平均高达147.56 ng/mL，几乎是未用H2O2处理的基线细胞记录浓度的2.5倍 - 56.86 ng/mL）（?1) recorded at 1 hour after the application of the oxidative stimulus in the absence and presence of digestion products (bioaccessible SFN (diluted 1?:?10 (v/v) to achieve the final concentration of 0.007 μg mL?1in the wells) from broccoli stalks). Distinct lowercase letters indicate values significantly different at p < 0.001 according to one-way analyses of variance (ANOVA) and Tukey's multiple range test (n = 3).">图2）。
或者，当上皮细胞用含有0.072 μg/mL SFN的西兰花茎秆生物可利用部分预处理（稀释1:10，v/v，以达到孔中最终浓度0.007 μg/mL）时，COX-2表达的增加被阻止，平均值为92.07 ng/mL，显著低于阳性对照（图2中的黑色虚线）。
这些结果表明，生物可利用的SFN可以下调由促氧化条件（50 μM H2O2）诱导的COX-2表达。值得注意的是，这种效应反映了对COX-2表达的调节，而不是直接抑制COX-2的酶活性。因此，SFN不是COX-2活性位点的经典抑制剂；相反，其抗炎活性主要通过上游调节机制介导，包括抑制NF-κB和MAPK信号通路以及激活Nrf2/HO-1通路，这些共同调节COX-2基因转录。因此，相对较低的浓度可能通过转录水平的信号放大机制引发显著的生物学效应，而无需与酶的催化位点直接相互作用。然而，尽管生物可利用的SFN与西兰花茎秆抗炎能力之间存在显著相关性，但西兰花茎秆粉的胃肠道消化可能产生额外的生物活性化合物，即使浓度低于定量限（微量，例如5-咖啡酰奎尼酸和对香豆酰奎尼酸）。
这些额外的生物活性分子可能有助于抑制COX-2表达，从而增强西兰花茎秆生物活性成分的抗炎潜力，或者它们可能拮抗SFN的生物活性，从而限制其实际的抗炎能力。为了克服这一限制并进一步证实生物可利用SFN降低COX-2表达的潜力，开发并评估了一个模型系统，该系统由SFN溶液组成，其浓度范围从几乎记录的生物可利用部分浓度开始递减（0.100、0.050、0.025、0.013和0.007 μg SFN/mL）（?1 in the well) recorded at 1 h after oxidative stimulus (50 μM H2O2) in the absence and presence of digestion products, and in a model system using dilutions (0.0100, 0.0050, 0.0025, 0.0013, and 0.0007 μg mL?1, final concentrations in the well) of the authentic SFN standard. Positive control (black dotted line): COX-2 expression in intestinal epithelial cells exposed to prooxidant conditions in the absence of bioactive compounds. Negative control (red dotted line): COX-2 expression in intestinal epithelial cells under basal (non-prooxidant) conditions. Distinct lowercase letters indicate values significantly different at p < 0.001 according to one-way analyses of variance (ANOVA) and Tukey's multiple range test (n = 3).">图3）。
当评估不含额外生物活性化合物的递减SFN浓度（在培养基中稀释1:10，以达到孔中最终浓度0.0100、0.0050、0.0025、0.0013和0.0007 μg SFN/mL）的能力时，发现它们都以相当（无显著差异）的水平降低了COX-2的表达（相对于在促氧化条件下维持的细胞降低了53.6%），这与生物可利用SFN发挥的抑制能力不同，后者将在氧化环境中记录的细胞COX-2表达减弱了37.6%（图3）。
这一结果强化了先前关于SFN通过食用西兰花茎秆产品预防副炎症综合征关键作用的证据，这些产品提供了能够下调COX-2表达的生物活性生物可利用部分。有趣的是，除了与生物可利用部分记录的浓度匹配的分离SFN的抑制能力外，抑制效率一直保持到测试的最低浓度（0.0007 μg SFN/mL），该浓度显著降低了促氧化环境诱导的COX-2表达；然而，这并未恢复到基线水平（阴性对照，由暴露于不含SFN和H2O2的消化空白补充培养基的Caco-2细胞组成，从而提供基础COX-2表达水平）（图3中的红色虚线），表明抑制效应与SFN暴露具体相关。这一结果不排除西兰花茎秆中额外的生物可利用分子可能发挥互补生物活性的贡献，从而增强整体抗炎效果。事实上，迄今为止，在鉴定具有生物活性潜力的分子以实现调节抗炎反应的功能相互作用（协同或拮抗）方面，特别是在具有不同化学特征的化合物中，仍存在知识空白。
关于SFN抑制COX-2依赖性炎症的机制，该化合物抑制NF-κB和MAPK通路。这些机制减少了额外的炎症介质（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8）。为了表征生物可利用SFN对副炎症的影响，我们专门针对COX-2类二十烷酸轴（PGE2、PGF2α、8-iso-PGF2α），因为这些是这一级联反应的既定功能标志物。因此，虽然监测额外的蛋白质水平标志物如丙二醛、谷胱甘肽或凋亡终点将提供互补分析，但我们有针对性的组合提供了生物可利用SFN调节的COX-2依赖性副炎症的直接证据。
观察到的生物可利用SFN对COX-2和类二十烷酸产生的抑制作用与其已建立的机制一致，涉及NF-κB和MAPK通路抑制以及Nrf2/Keap1抗氧化通路的强效激活，诱导HO-1。尽管对这些上游调节因子的直接评估超出了我们的实验范围（特别针对副炎症模型中的功能性COX-2类二十烷酸轴），但这些机制可能有助于SFN使用生物可利用的西兰花茎秆来源SFN观察到的异前列腺素和前列腺素类调节。
萝卜硫素对氧化应激和炎症相关类二十烷酸表达的影响
为了探究生物可利用SFN调节异前列腺素类（特别是被视为监测氧化应激金标准的8-iso-PGF2α）产生的能力，将肠道上皮暴露于促氧化环境（50 μM H2O2）。该处理使8-iso-PGF2α浓度从未刺激对照的平均3.6 ng/mL增加到平均9.8 ng/mL（1.7倍增加）在1小时后（?1) (8-iso-PGF2α, PGF2α, and PGE2) by bioaccessible SFN (diluted (v/v) 1?:?10 in culture media to achieve the final concentration of 0.007 μg mL?1in the well) at 1 hour post-oxidative stimulus (50 μM H2O2). Distinct lowercase letters indicate values significantly different at p < 0.001 according to one-way analyses of variance (ANOVA) and Tukey's multiple range test (n = 3).">图4）。
或者，用含有0.072 μg SFN/mL（稀释1:10，v/v，以达到孔中最终浓度0.007 μg/mL）的西兰花茎秆生物可利用部分预处理细胞，减轻了异前列腺素的增加，导致8-iso-PGF2α浓度相对于阳性对照（黑色虚线）降低了23.5%（图4）。
由氧化状态引起的继发性炎症反应通过测量前列腺素类PGF2α和PGE2的水平来监测。这些评估表明，当暴露于氧化条件1小时时（阳性对照，黑色虚线），Caco-2细胞产生高达129.8 ng/mL的PGF2α（平均比未处理细胞高37.8%）。这些生长条件也使PGE2浓度增加了67.2%（从1.7到4.1 ng/mL）（图4）。
与我们的初始假设一致，用生物可利用SFN预处理Caco-2细胞阻止了PGF2α和PGE2水平的增加，与阳性对照（黑色虚线）相比，浓度分别降低了23.0%和42.0%，尽管这些处理未达到基础条件（阴性对照，红色虚线）（图4）。
当分析生物可利用SFN调节COX-2表达的能力时，使用模型系统进一步证实了其抑制前列腺素类（氧化应激和炎症的标志物和介质）分泌的潜力（?1) of the isoprostane 8-iso-PGF2αand the prostaglandins PGF2αand PGE2by bioaccessible SFN (0.007 μg mL?1, final concentration in the well) recorded at 1 h after oxidative stimulus (50 μM H2O2) in the absence and presence of digestion products, and in a model system using dilutions (0.0100, 0.0050, 0.0025, 0.0013, and 0.0007 μg mL?1, final concentrations in the well) of the authentic SFN standard. Positive control (black dotted line): prostanoid concentrations in wells with intestinal epithelial cells exposed to prooxidant conditions in the absence of bioactive compounds. Negative control (red dotted line): prostanoid concentrations in wells with intestinal epithelial cells under basal (non-prooxidant) conditions. Distinct lowercase letters indicate values significantly different at p < 0.001 according to one-way analyses of variance (ANOVA) and Tukey's multiple range test (n = 3).">图5）。这种方法揭示了分离的SFN（不含额外植物化学物质）调节8-iso-PGF2α、PGF2α和PGE2分泌的能力。
对于8-iso-PGF2α，观察到了某种波动的模式。虽然生物可利用SFN显示出降低该氧化应激标志物的趋势（与阳性对照相比平均降低了29.4%），但并非所有浓度下的降低都显著（图5）。有限的能力与SFN的结构限制相符，这赋予了该ITC间接抗氧化特性。这种类型的抗氧化化合物激活Keap1/Nrf2/ARE通路，从而诱导催化直接抗氧化剂合成的细胞保护酶的表达。因此，SFN的间接抗氧化功能是延迟的，这可能无法实现，这与其通过异前列腺素上调控制细胞对氧化应激反应的能力有限相一致。相比之下，SFN调节炎症介质的公认能力通过降低几乎所有测试浓度下的PGF2α和PGE2浓度得到证明。有趣的是，尽管两种前列腺素类都减少了，但它们的具体反应不同。
在模型系统上，真实SFN标准的递减浓度逐渐降低了PGF2α的分泌，从生物可利用SFN（0.007 μg/mL）达到的水平降至74.8 ng/mL，分别对应于PGF2α降低22.9%和42.4%（图5）。或者，模拟中达到的PGE2水平在几乎所有测试的SFN浓度范围（除了0.0007 μg SFN/mL）都显著更高（图5）。
这一结果表明，生物可利用SFN通过调节特定介质表现出强大的抗炎能力，且不依赖于过程的起源（直接炎症或副炎症）。然而，这种生物效力可能在某种程度上取决于培养基中是否存在额外的生物活性化合物，这些化合物将微调单个有机硫化合物的抗炎能力。事实上，这些加性或协同效应可能归因于，例如，西兰花茎秆生物可利用部分中也描述的咖啡酰奎尼酸和对香豆酰奎尼酸，它们的抗炎能力也已得到证实。
根据本研究描述的主要结果，SFN通过COX-2调节前列腺素分泌的能力可以影响副炎症综合征的发生和进展，特别是考虑到报告的炎症性前列腺素谱与白细胞介素水平之间的密切联系。
结论
从本研究中获得的结果进一步支持了西兰花茎秆（一种未充分利用的副产品）作为SFN来源的潜力，描述了其生物可利用性（消化释放和稳定性）。由于在消化过程中的物理化学条件和酶活性下的不稳定性，从植物材料的GSL谱预期的多种ITCs和吲哚未以可定量浓度存在于生物可利用部分。尽管一系列ITCs和吲哚发生降解，但评估预防氧化应激继发性副炎症综合征的能力时，发现生物可利用SFN可以预防副炎症。使用模拟其在肠道管腔中浓度的模型系统评估生物可利用SFN的生物活性表明，这种具有推定生物活性的有机硫化合物是主要抗炎活性的原因，并且在较小程度上是预防氧化应激的原因。总之，这些结果表明，将西兰花茎秆粉与从农业食品副产品或可食用材料来源获得的其他成分（具有显著的抗氧化潜力）相结合，可以应对与氧化应激继发性副炎症综合征相关的所有生物学途径。
