《Lab on a Chip》：Intelligent image-activated sorting of large cells enabled by elasto-inertial focusing
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作为本期亮点，我们推荐这篇开创性研究。该工作成功开发了基于弹惯性聚焦的图像激活细胞分选（IACS）系统，解决了大细胞（>20 μm）、细胞簇等大型物体在高速（~1 m s?1）流式图像分选中的核心难题。系统通过长程微通道结合粘弹性流体，实现了大型粒子在≥35 mm距离内的稳定中心聚焦，并集成了基于卷积神经网络（CNN）的实时图像分析。实验证明，该系统对混合尺寸粒子分选的纯度达96.0%、回收率达80.5%（事件率172 eps），并对纤细裸藻（Euglena gracilis）基于胞内脂滴实现了4.5倍富集。这项技术为基于高内涵形态学分析的大细胞高通量分选开辟了新途径。
弹惯性聚焦实现的智能图像激活大细胞分选
引言
图像激活细胞分选（IACS）能够基于细胞的实时图像分析进行高速分选，为在单细胞水平上大规模关联细胞形态与功能提供了强大工具。尽管IACS已成功应用于多种中小型细胞，但将其应用于大细胞（>20 μm直径）、细胞簇和其他大型物体仍然面临挑战，而这在科学和工业领域具有重要价值。主要困难在于如何在微流控芯片内，从入口到出口（尤其是图像采集和分选区域）全程控制大而复杂的细胞。传统的基于水动力聚焦的IACS系统难以在图像处理所需的时间间隔内维持大物体的稳定聚焦，导致分选纯度、回收率或事件率降低。为了克服这些限制，本研究报道了一种基于弹惯性聚焦的IACS系统，该系统能够在~1 m s?1的高流速下实现大细胞的IACS。
弹惯性聚焦基IACS系统
本研究开发的弹惯性聚焦基IACS系统示意图展示了其用于大细胞图像激活分选的工作原理。该系统基于先前报道的智能IACS，无缝集成了几个关键组件：一个用于在长微通道中心维持大物体聚焦的弹惯性聚焦器；一个基于虚拟冻结荧光成像的光机械显微镜，用于以0.361 μm/像素的分辨率高速获取无模糊的双通道荧光图像；一个用于测量细胞流速的速度计；一个用于实时处理细胞图像并做出分选决策的智能图像处理器；以及用于在细胞流经芯片时快速分离目标细胞的片上双膜推拉泵。引入的弹惯性聚焦器是一个长66 mm、横截面为正方形（边长120 μm）的直微通道。聚焦器由环烯烃聚合物（COP）制成。聚焦器将细胞流维持在微通道中心，细胞在距入口31-32 mm处被光机械显微镜成像，图像由智能图像处理器分析。利用速度计预测的分选时机，目标细胞由双膜泵分选。本研究使用0.1%（w/v）透明质酸钠（HA）溶液作为聚焦介质。
弹惯性聚焦器的评估
使用不同尺寸的聚苯乙烯（PS）颗粒评估弹惯性聚焦器的性能。将直径为10.3 μm、14.5 μm和24.5 μm的PS颗粒悬浮液注入聚焦器，流速为420 μL min?1（对应于通道中心最大流速~1 m s?1）。通过高速相机记录颗粒在不同入口距离（L）处的流动，并测量每个颗粒相对于微通道中心的垂直距离（d）。随着L增加，所有尺寸的颗粒都显示出逐渐变窄的单峰分布，中心在-2 μm < d < 2 μm范围内，表明在弹惯性聚焦器中实现了有效聚焦。更定量的分析显示，24.5 μm和14.5 μm颗粒的d标准差（SD）随L增加而减小，在L > 30 mm时分别达到<2 μm和<8 μm。这个L范围覆盖了从成像区域（L = 31-32 mm）到分选区域上游边缘（L = 66 mm）的整个距离。虽然10.3 μm颗粒的SD也随L逐渐减小，但总体聚焦效果不如大颗粒，仅在L > 45 mm时SD < 12 μm。这些结果表明，我们的聚焦器能够可靠地维持直径至少14.5 μm的物体（包括直径达24.5 μm的颗粒）在1 m s?1流速下聚焦36 ms，超过了先前IACS演示的物体尺寸。
为了验证弹惯性聚焦对生物细胞的适用性，接下来让纤细裸藻（Euglena gracilis）细胞以相同流速流经聚焦器，并将其聚焦性能与14.5 μm颗粒（其直径与细胞宽度相当）进行比较。细胞的位移d分布随L增加显示出逐渐变窄的峰值，但其d的SD在L > 30 mm时稳定在约10 μm，是颗粒观察值的两倍多。细胞聚焦性能的降低主要归因于细胞形态更大的变异性。细胞聚焦性能与细胞面积、纵横比、短轴和长轴的进一步分析表明，较大的纵横比较短的短轴与聚焦性能受损相关。
图像激活颗粒分选
为了验证弹惯性聚焦基IACS系统，我们进行了荧光PS颗粒的图像激活分选。制备了24.5 μm和14.5 μm PS颗粒的1：1混合物，其中24.5 μm颗粒被指定为分选目标。在分选前，每个颗粒群体被IACS系统单独成像。使用3635张目标和6863张非目标的IACS图像预训练了一个LeNet-5-dropout卷积神经网络（CNN）模型。训练和验证准确率在20个训练周期后接近100%。该模型在保留数据上测试时达到了99.88%的精确度和99.89%的召回率。然后将该模型应用于颗粒混合物IACS期间的实时分类。在172 eps的事件率下，96.9%的事件在32 ms内被处理完毕，这是我们的IACS系统中颗粒从成像区域行进到分选区之前进行图像处理和决策所需的实际最小时。在此事件率下，计算得出的纯度和回收率分别为96.0%和80.5%。纯度在更高的264 eps（92.6%）和312 eps（92.6%）事件率下仍保持较高水平。然而，随着事件率增加，在32 ms内处理的事件比例下降至61.0%（264 eps）和32.7%（312 eps），导致相应的分选回收率下降至51.9%和23.1%。这些结果突显了在使用基于深度学习的分类模型的IACS系统中需要更长的处理时间，因此维持大物体的长距离聚焦流动至关重要。
纤细裸藻细胞的图像激活分选
最后，我们基于胞内脂滴含量（一个需要图像进行细胞分类的形态学特征）对纤细裸藻细胞（宽度5-20 μm，长度20-50 μm的微藻细胞）进行了IACS，分类由系统的CNN模型判断。为了准备模型的图像数据集，我们开发了一个自定义Python程序，通过阈值化BODIPY 505/515荧光的局部强度最大值来检测脂滴中心。该程序应用于IACS系统获取的细胞图像。检测到脂滴的细胞被标记为分选目标，而没有脂滴的细胞则被标记为CNN模型构建的非目标。使用3635张目标图像和6863张非目标图像训练了一个8层CNN。训练后的模型在第217个训练周期达到了82.0%的精确度和97.5%的召回率。
然后将这个训练好的CNN模型应用于纤细裸藻细胞的图像激活分选。在IACS期间实时获取的目标和非目标细胞的图像库显示，被分类为目标的细胞在BODIPY荧光通道中表现出更强、更明显的液滴模式，而被归类为非目标的细胞在BODIPY通道中显示很少信号或存在裁剪伪影。在128 eps的事件率下，88.2%的图像在32 ms内被基于CNN的分类处理完毕。分选后，我们通过应用上述相同的自定义脂滴计数程序来评估CNN模型的决策。结果显示，73.67%的目标细胞（3638/4938个细胞）被CNN模型正确分类为含有≥1个脂滴，而5.12%的非目标细胞（915/17867个细胞）被误分类为含有≥1个脂滴。
我们进一步评估了从IACS系统收集的分选后样品。将从未经分选和经过分选的微流控芯片出口收集的细胞分别通过离心浓缩，转移到载玻片上，并在商业荧光显微镜下成像。用于CNN模型构建的相同程序应用于这些显微镜图像以计数含有脂滴的细胞。在检查的160个分选后细胞中，86个细胞（53.8%）含有脂滴，而在270个分选前细胞中只有32个（11.9%）含有脂滴，这对应于我们的弹惯性聚焦基IACS对纤细裸藻细胞实现的4.54倍富集。这些结果表明，我们的系统能够基于内容丰富且实时的图像分析实现大细胞的高速分选。值得注意的是，与在相当或更高事件率下的颗粒分选相比，纯度较低可归因于聚焦性能的下降。细胞的聚焦不如14.5 μm颗粒稳定。聚焦的波动导致细胞流速的变化，这使得分选驱动的精确同步变得复杂，从而降低了分选准确性。
讨论
在本研究中，我们提出并通过实验证明了弹惯性聚焦基IACS，它能够在不影响分选纯度、回收率或通量的情况下，基于高内涵和实时图像分析实现大细胞的高速分选。通过将弹惯性聚焦与长微通道相结合，大细胞可以在长距离内被聚焦，从而为基于深度学习的图像分析提供足够的计算时间，同时保持高流速。我们首先通过在172 eps事件率下以96.0%纯度和80.5%回收率进行大PS颗粒的图像激活分选，然后通过在128 eps事件率下以73.67%的实时图像分类准确率和4.54倍富集比进行纤细裸藻细胞的IACS，证明了我们系统的能力。与其他报道的兼容基于深度学习的内容丰富图像分析的IACS系统相比，我们的系统独特地演示了迄今为止最大细胞的IACS，同时保持了>100 eps的高事件率。此外，我们的弹惯性聚焦器无需鞘流即可运行，无需复杂的微通道设计或精密的流量控制模块。
我们的弹惯性聚焦基IACS系统的技术能力可以进一步扩展。首先，可以通过优化计算网络来提高通量。在这项工作中，有限的处理速度导致在定义的32 ms窗口内处理图像的比例减少，使得回收率在264 eps时降至51.9%，在312 eps时降至23.1%。增强计算机硬件或采用并行计算将提升计算能力，从而允许更高比例的图像在规定时间内得到处理。改进微流控通道设计，包括弹惯性聚焦器和双膜泵井，也可以提高性能。例如，延长聚焦器将为图像处理提供额外时间。在这项研究中，我们采用了基于COP的片上双膜推拉泵进行分选驱动。虽然基于COP的微流控芯片成本相对较低，但材料杨氏模量限制了可实现的最大驱动频率。这一限制可以通过使用更硬的材料（如硼硅玻璃）制造芯片或采用更快的分选机制（如基于声学的分选或基于微气泡的分选）来解决。值得注意的是，我们的工作是首次演示将粘弹性流体聚焦与基于压电驱动器的主动分选（即由微通道外部施加的力激活的分选）相结合。优化分选区域的设计可以进一步提高通量、回收率和纯度。我们预计，这些计算和微流控技术的改进也将使得能够集成能够处理更高内涵图像（如多通道、三维（3D）和超分辨率图像）的分类方法，而不会影响通量。特别地，对于大物体，实施3D图像至关重要，因为与单平面2D图像相比，3D图像能以更高的准确性和可重复性反映完整的形态学特征。实现大物体稳定分选性能的一个潜在限制是颗粒间距。随着物体尺寸和体积浓度的增加，相邻物体更有可能发生耦合振荡运动，导致流速波动增加，从而降低分选回收率和纯度。可能需要进行进一步的调查和应用特定的分选性能优化。
在进一步应用方面，我们期望我们的IACS系统可应用于多种大细胞或细胞簇，以实现基于多样化形态学特征的IACS。以纤细裸藻为例，我们展示了基于凝聚脂滴存在的IACS，这是先前的高通量微流控分选技术无法利用的特征。这种能力可能有助于全面研究与脂滴凝聚相关的表型-基因型关联，从而拓宽对纤细裸藻的认识，并支持其在代谢工程和生物燃料生产的菌株工程中的应用。此外，我们的IACS系统可以基于形态学特征的组合对纤细裸藻细胞进行分选，以富集专门生产特定生化化合物、具有特定光合活性或重金属去除能力的亚群。除了纤细裸藻，我们预计我们的系统可以扩展到更大生物物体的高通量分选，特别是由患者细胞培养的球体和类器官。尽管它们有望作为可扩展的个体化疾病模型，用于体外评估治疗效果，但它们固有的形态和组成变异导致疗效测试的再现性和可靠性较低，这为其临床应用带来了挑战。分离具有特定形态特征的类器官或球体可以减少药物反应的变异，从而实现更可靠的个性化预后。虽然本研究开发的聚焦器仍存在局限性，包括对小的单细胞（直径<10 μm）聚焦效率低，或与接近或超过微通道边长（120 μm）的物体不兼容，但这些挑战可以通过设计优化来解决。例如，制造具有更大横截面的聚焦器将扩展其对更大分选靶标的适用性。我们测试了具有更宽横截面（边长150 μm）的聚焦器设计，并确认了对直径14.5 μm、24.5 μm和51.0 μm颗粒在长距离内的有效弹惯性聚焦。我们预计，由于弹惯性聚焦已在广泛的流变参数范围内得到验证，更大的微通道可以集成到IACS系统中用于分选更大的物体。在活细胞分选应用中，弹惯性聚焦下的细胞活力是一个重要的考虑因素。先前的研究报道了纤细裸藻细胞在流经FACS系统的狭窄微通道后活力降低，表明其对高剪切应力敏感。因此，在为活细胞应用调整聚焦器和分选器设计时，仔细控制应力至关重要。通过这些调整，我们的IACS系统可以适应更多样化的需求，从而在生物医学和环境应用中实现大细胞或细胞簇形态特征与细胞功能之间的全面关联分析。
