《Journal of Electroanalytical Chemistry》：Dual-mode electrochemical and electrochemiluminescent strategy for microRNA-183 detection on polyacrylamide-grafted magnetic nanocomposite
编辑推荐：
聚丙烯酰胺（PAM）改性磁性纳米复合材料用于双模式电化学（EC）和电化学发光（ECL）检测miRNA-183-5p，通过化学共沉淀、微波硅化物层和超声聚合法构建，在复杂基质中实现0.01-1000 aM线性响应和9.9-4.1 aM检测限，兼具高灵敏度与抗干扰能力。
Dereje Kenea Fayisa | Muhammad Faizan | Wei-Chi Wu | Jem-Kun Chen | Chi-Hsien Liu
台湾国立科技大学材料科学与工程系，基隆路43段4号，台北106，中华民国
摘要
本文报道了一种集成双模式电化学（EC）和电化学发光（ECL）策略，利用聚丙烯酰胺接枝的磁性纳米复合平台实现对microRNA-183的灵敏检测。该纳米复合体通过化学共沉淀法制备磁性纳米颗粒，随后通过微波辐照涂覆二氧化硅，并通过超声聚合接枝聚丙烯酰胺而制成。全面的物理化学表征证实了纳米复合体的成功合成及其逐步的表面改性。我们使用循环伏安法和电化学阻抗谱对层状改性后的纳米复合体的电化学性质进行了分析。该生物传感器通过三明治型检测方法实现了miRNA-183-5p的双模式检测，该方法包括表面固定的捕获探针、生物素化的检测探针以及链霉亲和素-辣根过氧化物酶放大系统。在磷酸盐缓冲盐水、尿液和血清基质中，该平台在0.01–1000 aM的浓度范围内表现出线性响应，EC检测的检出限为9.9–4.6 aM，ECL系统的检出限为5.1–4.1 aM。这种环保的双模式平台展示了原子级分析灵敏度、高重复性和强基质耐受性，凸显了其作为超灵敏核酸分析概念验证策略的潜力。
引言
微小RNA（miRNAs）是一类短的非编码RNA分子，它们通过与信使RNA转录本结合并调节其稳定性和翻译来在转录后水平上调控基因表达[1]、[2]。由于miRNA的表达谱反映了细胞的动态状态，因此miRNA表达的失调越来越多地与复杂疾病相关联，包括癌症、神经系统疾病以及内分泌相关疾病（如甲状旁腺功能亢进），这使miRNAs成为有价值的诊断和预后生物标志物[3]、[4]。这种生物医学重要性迫切需要能够在实际样品基质中以高灵敏度和可靠性定量微量miRNAs的分析方法，这对于理解疾病机制和实现准确的分子诊断至关重要[5]。在癌症相关靶标中，microRNA-183（miR-183）特别值得关注，因为它的功能作用具有依赖性，根据癌症类型和表达水平的不同，它可以作为致癌基因或肿瘤抑制因子，从而使其成为癌症诊断和预后的有希望的生物标志物[6]。
尽管传统的核酸检测方法（如定量逆转录PCR（qRT-PCR）、Northern印迹和DNA微阵列已经成熟，但由于多步骤工作流程、严格的温度控制、昂贵的仪器设备以及不适合快速或即时检测的限制，这些方法的广泛应用受到了限制[7]。这些实际问题促进了电化学（EC）和电化学发光（ECL）生物传感器的开发[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。在这些平台上，表面限定的DNA探针通过杂交识别目标miRNAs，并将结合事件转化为电信号和/或光信号。电分析方法的固有优势，如微型化、低样品消耗、良好的灵敏度和与复杂基质的兼容性，支持了它们在核酸诊断中的日益重要的作用[15]、[16]、[17]。然而，miRNA检测的分析可靠性常常受到界面非特异性吸附、基质诱导的污染和信号漂移的影响，这些在极低目标浓度下尤为明显。
ECL提供了一种有吸引力的信号输出方式，因为光发射源自电极表面的电化学激发态，消除了外部光激发，从而减少了背景噪声并简化了仪器设备[18]。当与Ru(bpy)32+或鲁米诺等发光剂结合，并通过酶促或纳米材料放大时，ECL可以在复杂基质中提供高信噪比和低检测限[19]。尽管如此，单模式检测（仅EC或仅ECL）仍然容易受到非特异性结合、基质依赖的淬灭或污染以及界面电子转移效率波动的影响而产生假阳性结果。为了提高分析结果的可靠性，已经提出了在同一界面上集成EC和ECL信号的双模式策略，以实现内部交叉验证；例如，已经设计了自供电的DNA酶行走系统来产生同时的EC和ECL信号以进行验证[20]。即便如此，针对miRNAs的双模式EC/ECL生物传感器仍然相对较少，专门用于miR-183-5p检测的平台也尚未得到充分发展，这表明有必要进行合理的界面设计，以同时提高灵敏度和稳健性。
从电分析化学的角度来看，界面工程对于提升性能至关重要，因为生物识别层直接控制电荷转移、质量传输和背景抑制。因此，纳米材料被广泛用于增加电活性表面积并加速界面电子转移[21]。虽然石墨烯衍生物、碳纳米管和量子点经常被用作导电或信号放大支架，但磁性纳米颗粒（MNPs）通过结合分离/富集和检测功能提供了独特的优势。它们的高表面积与体积比使得探针能够密集固定，其磁性响应性有助于快速从复杂基质中富集目标物质，减少背景干扰并提高选择性[22]、[23]、[24]、[25]。然而，裸露的MNPs容易氧化、聚集且水溶性差，这会降低稳定性和生物相容性[26]。一种常见的解决方案是用二氧化硅（SiO2）包覆MNPs，以提供化学保护和富含羟基的表面，适合通过硅烷偶联剂（如甲基丙烯氧基丙基三甲氧基硅烷（MPS）进行共价功能化[27]。在这种方案中，MPS通过三甲氧基硅基团锚定在二氧化硅上，而甲基丙烯酸酯部分提供用于自由基聚合的乙烯基功能，作为无机相和聚合物相之间的反应性桥梁[28]。将聚丙烯酰胺（PAM）接枝到SiO2包覆的MNPs上，可以形成稳定的水合聚合物壳层，提高胶体稳定性并支持目标识别[29]。重要的是，PAM形成了多孔且电化学惰性的水凝胶微环境，促进了质量传输，稳定了酶，并提供了反应中间体的局部限制。与带电聚合物（如壳聚糖）或屏蔽层（如PEG）相比，中性的PAM网络可以增强辣根过氧化物酶（HRP）的转化速率，并促进有利的界面电子转移动力学[30]、[31]。此外，其3D纳米通道结构可以在电极界面附近富集氧化还原介质和ECL共反应物，为增强双模式信号放大提供了机制上的支持。尽管已经探索了PAM接枝共聚物用于敏感的小分子检测[32]、[33]，但将其转化为用于miRNA分析的双模式EC/ECL生物传感器仍然有限，主要是因为制备参数（颗粒大小、形态和聚合物结构）对界面电荷转移行为和整体分析性能有重要影响[34]。
在这里，我们开发了一种基于PAM接枝磁性纳米复合体的双模式EC/ECL生物传感器，用于检测miRNA-183-5p。所设计的界面将磁性富集和基质清洗与水合的PAM网络相结合，支持高效的探针固定和酶促放大。同时，EC和ECL提供了来自同一杂交事件的相关电信号和光信号，实现了相互验证并提高了对基质干扰的抵抗力。这项工作提出了一种通过整合PAM接枝磁性纳米复合体和双模式EC及ECL转换来实现原子级miRNA检测的电分析策略。所提出的平台为miR-183-5p分析提供了一个典型的例子，并为超灵敏核酸诊断提供了概念验证的途径。
材料
四水合氯化铁（II）（98%）、六水合氯化铁（III）（97%）、过硫酸铵（98%）、牛血清白蛋白（BSA）、戊二醛（25%）、氢氧化钠（NaOH）、对苯二酚、六氰合铁（II）三水合物和人血清（H4522）均从Sigma-Aldrich购买。鲁米诺从日本TCI购买。3-甲基丙烯氧基丙基三甲氧基硅烷（MPS，97%）来自东京化学工业公司（日本）。四乙基正硅酸盐（TEOS，98%）和超纯级丙烯酰胺
磁性纳米材料的合成优化
磁性纳米颗粒（MNP）采用化学共沉淀法合成[38]，并在90°C和200 W的微波水热处理下辅助制备。系统地优化了关键反应参数，包括反应时间、温度和NH?OH浓度，以增强MNPs的磁性能。采用了一次只改变一个参数的方法，其他参数保持不变。图1(A)展示了NH?OH的影响
结论
在这项研究中，通过包括化学共沉淀、二氧化硅涂层、MPS硅烷化和自由基聚合的逐步路线合成了环保的聚丙烯酰胺（PAM）接枝磁性纳米复合体。结构、形态、热性能和电化学分析证实了其成功形成和功能化。阶段分辨的电化学测量显示了电子转移动力学、电活性表面积和电荷转移阻力的系统变化
CRediT作者贡献声明
Dereje Kenea Fayisa：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理、概念化。Muhammad Faizan：研究。Wei-Chi Wu：资源获取、资金筹集。Jem-Kun Chen：资源获取、资金筹集。Chi-Hsien Liu：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、概念化。
未引用的参考文献
[35], [36], [37]
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢国家科学技术委员会（114-2221-E-182-019, IIPP）、台湾教育部（TEEP）和长庚纪念医院（BMRP758）对作者的资助和支持。作者感谢CGU的仪器中心和显微镜中心以及CGMH的显微镜中心在形态分析方面的帮助。
