双相转录调控机制使得Stutzerimonas degradans BP在盐胁迫条件下能够高效进行反硝化作用

高盐氮废水处理中卤耐菌Stutzerimonas degradans BP的研究表明其在4%盐度下实现96.43%总氮去除率，最佳盐度为2.2%。通过基因组注释和实时荧光定量PCR证实，高盐条件下该菌采用双阶段转录调控策略，适应期上调napA、nirS、nosZ基因，脱氮期narG主导并下调相关基因表达。

　　

牛彦杰|毕秋文|王进|岳正波|王美晨|姜一帆|王书

安徽工业大学资源与环境工程学院，中国合肥230009

摘要

高盐度含氮废水的处理是一个重大挑战，因为这会抑制微生物的氮去除作用，而有效的耐盐厌氧细菌可以缓解这一问题。本研究表明，在30°C温度下，以乙酸钠作为碳源时，耐盐反硝化菌株Stutzerimonas degradans BP即使在4%的高盐度下也表现出优异的反硝化性能，总氮去除效率达到了96.43% ± 0.37%。高斯函数模型预测，最佳反硝化效率出现在盐度为2.2%时。基因组注释和氮平衡分析结合RT-qPCR验证证实，在厌氧高盐条件下，99.41% ± 4.53%的还原硝酸盐通过反硝化途径转化为N₂。在高盐度胁迫（≥ 4%）下，S. degradans BP采用了两相转录调控策略。在盐度适应阶段，napA、nirS和nosZ的基因表达水平相比2%盐度组上调，以抵消抑制作用；而在进入氮去除阶段时，表达模式转变为以narG为主，而nirS、norB和nosZ的表达水平下调。适应过程中电子向兼容溶质（脯氨酸/谷氨酸）的重新分配导致初始活性受到抑制。本研究阐明了耐盐厌氧反硝化菌在高盐度胁迫下的响应机制，并提出了其调控层次结构的盐度依赖性简化方案。这些发现为高盐度废水处理的生物强化提供了理论基础和微生物资源。

引言

随着全球环境管理要求和标准的不断提高，来自食品加工、海洋水产养殖和石油化工行业的高盐度和高氮工业废水的处理成为传统污水处理厂面临的主要挑战[1]、[2]。高盐度和高氮负荷严重抑制了微生物活性，降低了生物反硝化过程的系统效率[3]、[4]。此类废水中的盐分通过渗透压应力破坏细胞膜完整性，干扰酶的构象，并干扰电子传递[5]、[6]。这种抑制作用在反硝化过程中的亚硝酸盐还原酶（Nir）上尤为明显，导致NO_–2-N的积累[7]。尽管已经开发了物理化学方法（如离子交换法和反渗透法）来去除废水中的氮，但其成本和二次污染风险较高。因此，开发高效的生物处理技术以提高反硝化单元的生物活性仍是一个紧迫的任务。

据报道，好氧耐盐反硝化菌（如Pannonibacter phragmitetus B1和Acinetobacter oleivorans AHP123）由于缺乏nos基因，能够将NO_–3-N转化为N₂O，但这仍然存在环境风险[8]、[9]。相比之下，兼性厌氧反硝化菌Marinobacter sp. W-8在低氧条件下实现了高效反硝化，即使在6%的盐度下也能去除87.63%的氮，并且N₂O的排放量低于1%[10]。然而，关于厌氧或兼性厌氧耐盐反硝化菌的研究相对较少，对其适应机制的深入分析也缺乏[11]、[12]。

耐盐微生物通常通过积累兼容溶质（脯氨酸、谷氨酸）或调节离子平衡（K⁺/Na⁺）来应对高盐度胁迫，以减轻生理损伤[13]、[14]。目前，关于不同盐度胁迫下生物反硝化响应机制的研究主要集中在生物反应器群落上。盐度变化显著调节了生物电化学反应器中napA、nirK和nirS等反硝化基因的丰度和表达，从而影响反硝化性能[11]。盐度胁迫（Na⁺）破坏了序贯批次反应器中的细菌群落平衡，并增强了narH基因的表达，导致亚硝酸盐的积累[15]。然而，目前仍难以区分反硝化性能的变化是由于功能菌株对盐度的直接生理反应，还是由于不同微生物之间的复杂相互作用（包括竞争和共生）[16]、[17]。因此，迫切需要在单菌株水平上进行全面研究，以表征反硝化性能，并阐明耐盐反硝化菌在盐度梯度下的代谢途径和内在分子调控机制（基因表达、酶活性）。

本研究使用了一种高效厌氧反硝化菌Stutzerimonas degradans BP，该菌株之前从工业废水处理厂的活性污泥中分离得到，旨在直接研究其在单菌株水平上对盐度胁迫的反硝化响应[18]。具体目标是：(1) 系统分析盐度范围从0%到8%对特定生长率、NO_–3-N去除率和总氮去除效率的影响；(2) 识别厌氧高盐条件下的氮去除途径和最终产物；(3) 阐明盐度胁迫期间基因表达、酶活性和反硝化功能之间的响应机制。本研究旨在为高盐度条件下的生物反硝化适应机制提供新的见解，从而为废水工程中的靶向生物强化奠定微生物和理论基础。

材料

S. degradans BP是从一家工业废水处理厂的活性污泥中分离得到的，已存入广东省微生物保藏中心（GDMCC编号64297）[18]。实验中使用的反硝化培养基（g·L^–1）包含KNO₃（相当于150 mg·L^–1 NO_–3-N）；CH₃COONa（相当于1,200 mg·L^–1 TOC）；K₂HPO₄·3H₂O（6.26）；KH₂PO₄（1.24）；MgSO₄（0.20）；微量元素溶液（2 mL·L^–1）；并根据需要添加NaCl

盐度胁迫对S. degradans BP生长和反硝化的影响

通过对S. degradans BP在不同盐度下的生长动力学和反硝化性能进行系统评估，结果表明其生理活性和反硝化效率具有盐度依赖性（图1a–d）。S. degradans BP在0%到4%的盐度范围内表现出高效的氮去除能力。具体来说，在0%和2%的盐度下，该菌株在24小时内完成了大部分NO_–3-N的去除

S. degradans BP的氮去除性能优势和盐度适应性

S. degradans BP在反硝化性能和盐度适应性方面表现出显著优势。高斯函数模型拟合的结果（图1e）显示，其最佳反硝化盐度为2.2%，此时特定生长率（0.19 h^–1）和NO_–3-N去除率（29.61 mg·L^–1·h^–1）几乎同时达到峰值。这一最佳值反映了渗透调节的能量成本和离子毒性之间的平衡。当盐度低于2.2%时

结论

本研究显示，厌氧反硝化菌S. degradans BP在盐度范围从0%到4%的情况下，通过反硝化作用实现了超过96.43% ± 0.37%的总氮去除率，高斯模型预测最佳反硝化盐度为2.2%。在高盐度胁迫（≥ 4%）下，S. degradans BP采用了两相转录调控策略。在盐度适应阶段，napA、nirS和nosZ的基因表达水平相比2%盐度组上调

未引用的参考文献

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CRediT作者贡献声明

毕秋文：写作 – 审稿与编辑、验证、方法学、调查、数据管理、概念构建。 牛彦杰：写作 – 原稿撰写、可视化、验证、方法学、概念构建。 岳正波：写作 – 审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金获取。 王书：写作 – 审稿与编辑、验证、监督、资金获取、概念构建。 姜一帆：方法学研究。 王美晨：方法学研究。 王进：写作 –

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号42577236、42472373、22306050）和中央高校基本科研业务费（项目编号JZ2024HGTB0247）的支持。