《Advanced Science》：Astrocyte Enrichment of 3D Cortical Constructs Enhances Brain Repair
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本文综述并实验探究了星形胶质细胞在人神经祖细胞（NPC）三维培养及植入治疗创伤性脑损伤（TBI）中的关键作用。研究表明，将星形胶质细胞与NPC构建成共培养微流控三维结构后植入，可显著增强神经元存活与成熟、促进血管耦合、减少病灶体积并改善宿主-移植物整合，为神经再生医学提供了新的优化策略。
摘要
再生医学为治疗脑损伤提供了新希望，但促进神经元存活与整合仍是挑战。星形胶质细胞在神经元发育与修复中至关重要，它能释放生长因子、促进突触形成和血管生成。本研究探讨了将人神经祖细胞（NPC）单独或与小鼠星形胶质细胞共培养，并利用微流控技术形成三维（3D）结构后进行脑内移植的效果。结果表明，共培养体系显著增强了神经元的成熟度、存活率和密度。植入小鼠大脑后，共培养物减小了损伤病灶体积，促进了轴突生长，并增强了移植物内星形胶质细胞与血管的耦合。此外，我们发现NPC和共培养物均能增加植入物中星形胶质细胞的尺寸。高分辨率显微镜和光遗传学分析证实了宿主与移植物之间存在功能性突触连接。这些发现强调了星形胶质细胞在促进神经组织整合和推进脑损伤治疗中的关键作用。
1 引言
传统二维（2D）培养模型难以复制脑组织的复杂空间和机械特性，而三维（3D）结构（如脑类器官和生物打印结构）能更好地模拟大脑的微环境。微流控技术则能高通量生成3D结构。然而，现有模型仍难以完全复制人脑的细胞复杂性，神经元存活率低，部分归因于支持细胞（如星形胶质细胞）不足的仿生微环境。本研究旨在通过将人NPC单独或与小鼠星形胶质细胞共培养形成的3D结构植入免疫抑制小鼠的大脑皮层，探究星形胶质细胞在促进神经组织移植和功能恢复中的关键作用。
2 结果
2.1 共培养中的小鼠星形胶质细胞在体外和体内促进人神经元成熟
研究者假设，与小鼠原代星形胶质细胞共培养能增加人胚胎干细胞（hESC）来源的神经祖细胞（NPC）的活性和神经元分化。在二维（2D）单层培养中，与星形胶质细胞以1:3比例共培养4周后，神经干/祖细胞蛋白巢蛋白（Nestin）的表达降低，而深层神经元标记物CTIP2阳性的细胞核数量增加，表明星形胶质细胞促进了细胞谱系进展和神经元分化。qPCR分析显示，共培养组中神经发育转录因子PAX6和BRN2的表达显著增加。条件培养基分析发现，共培养组培养基中骨桥蛋白（OPN）和胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP-2）的表达显著上调。共培养还减少了MAP2+神经突的退化。将细胞悬液注射到新生小鼠运动皮层后，共培养组中表达神经元核抗原（NeuN）的HuNu+细胞比例更高，表明神经元成熟度增强。
2.2 共培养增强微流控生成的3D结构的活力和体外成熟
研究者使用定制微流控装置生成装载细胞的Matrigel液滴作为3D结构。在组装后3天（3 DPA），共培养结构的体积显著小于NPC单独结构，但细胞密度更高。活/死细胞检测显示，在3 DPA和14 DPA时，共培养结构中的死细胞（PI阳性）显著减少。在28 DPA时，共培养结构中成熟神经元（NeuN阳性）的比例更高。这些数据表明，在3D培养中，星形胶质细胞共培养同样能提高人细胞存活率和神经元分化。
2.3 星形胶质细胞促进共培养物植入后的TBI病灶恢复
将微流控生成的3D结构植入到创伤性脑损伤（TBI）小鼠模型的大脑皮层。大体形态分析显示，在损伤后14天（14 DP TBI），NPC植入组病灶明显，而共培养组病灶最小。在56 DP TBI时，NPC组仍可见疤痕，而共培养组皮层表面更平滑，病灶面积更小。免疫荧光分析显示，共培养植入物中有清晰的hNCAM+和HuNu+细胞簇，而NPC组在14 DP TBI时未检测到植入的hNCAM+细胞。到56 DP TBI时，两组均可见hNCAM+细胞，但共培养组的植入物体积更小。
2.4 植入增加了星形胶质细胞的尺寸和复杂性
分析植入物中星形胶质细胞（GFAP标记）的形态发现，无论是NPC还是共培养植入物中的星形胶质细胞，其面积、周长和复杂性（通过Sholl分析衡量）均显著高于对侧皮层。然而，两组植入物之间的星形胶质细胞在大多数参数上无显著差异。共培养组中，对侧皮层的星形胶质细胞尺寸和复杂性略小。使用S100β标记发现，两组植入物中星形胶质细胞密度相似。绝大多数植入物中的星形胶质细胞为小鼠来源（HuNu阴性）。
2.5 共培养植入物中星形胶质细胞与血管的耦合增强
星形胶质细胞支持血管发育并调节血脑屏障（BBB）。通过凝集素标记血管发现，两组植入物中的血管丰度相似。然而，共培养组中星形胶质细胞（GFAP+）及其终足标志物水通道蛋白4（AQP4）与血管（凝集素+）的共定位面积显著高于NPC组，表明星形胶质细胞与血管的物理联系更紧密，AQP4在血管上的覆盖更多，这暗示BBB功能可能得到改善。对β-肌营养不良聚糖的免疫组化分析显示，NPC植入物中存在异常的、片状的非极性表达结构（“旗帜”结构），而共培养组中此类结构面积显著更小。静脉注射70 kDa右旋糖酐（FITC标记）显示，两组植入物血管内荧光强度相似，且渗漏极少，表明血管已与宿主整合且功能完整。
2.6 共培养植入增强了移植物-宿主的解剖学整合
评估植入后56天的宿主组织整合情况发现，与NPC组相比，共培养组从植入物向外延伸的hNCAM+轴突在邻近皮层的相对面积更大，表明更多的轴突长入宿主组织。对胼胝体和纹状体中轴突投射的量化显示，共培养组单位体积植入物向胼胝体发出的轴突数量显著多于NPC组，而向纹状体的投射数量无统计学差异。
2.7 植入的人神经元在宿主皮层表达突触前和突触后标记物
对体外培养4周的3D结构进行免疫荧光分析发现，hNCAM+神经突起与突触后标记物PSD95存在大量重叠。在体内，对从植入物延伸到邻近皮层的hNCAM+轴突进行分析，发现其共表达突触后蛋白PSD95和突触前蛋白突触素（Synaptophysin, Syn）。定量分析表明，NPC和共培养组在hNCAM与PSD95或Syn的重叠百分比上相似，提示来自植入物的轴突正在宿主皮层形成或接收突触。
2.8 植入的人神经元与宿主大脑实现功能整合
为评估功能整合，研究者在植入前用携带ChR2-EYFP的腺相关病毒（AAV）载体转导3D结构。脑片膜片钳记录显示，光刺激ChR2-EYFP阳性的植入神经元能立即诱发其产生动作电位。同时，在植入物附近的ChR2-EYFP阴性宿主神经元中也能记录到由光刺激植入神经元诱发的去极化反应，表明植入神经元与宿主神经元之间形成了功能性突触连接。多电极阵列（MEA）记录进一步证实，光刺激植入物可引发周围皮层（最远达700微米）的神经元群体产生脑电波活动。
3 讨论
本研究表明，小鼠星形胶质细胞对共培养的人神经祖细胞（NPC）在体内外均产生多重有益效应。微流控技术能规模化生产可复制的3D结构，优于异质性大的类器官。星形胶质细胞提高了植入物的早期留存和稳定性，并显著减小了TBI病灶体积。星形胶质细胞并未增加植入物内血管密度，但增强了星形胶质细胞终足与血管的物理联系以及AQP4在血管上的定位，可能改善了血管功能。植入物中的星形胶质细胞（主要为宿主来源）尺寸和复杂性均显著增加。共培养促进了轴突向宿主皮层的延伸，并在胼胝体中观察到更多的轴突投射。电生理学证据证实了植入神经元与宿主神经元之间存在功能性连接。
本研究使用异时性共培养（即发育较晚的星形胶质细胞与较早的NPC共培养）和异种移植（人细胞植入小鼠）模型。分析显示共培养条件培养基中OPN和IGFBP-2表达上调。与小鼠星形胶质细胞相比，人星形胶质细胞共培养在2周时即显示出更强的促MAP2表达增加效应。宿主来源的小鼠星形胶质细胞在植入物中表现出尺寸和复杂性增加，提示植入物可能分泌促肥大因子。
研究的局限性包括需要评估长期效应、确定最佳星形胶质细胞来源和移植时机、在成年TBI模型中进行验证，以及进行行为学测试以证明功能恢复。此外，需考虑免疫排斥问题，本研究使用了免疫缺陷的NSG小鼠以避免此问题。
4 结论
本研究证明，将星形胶质细胞整合到微流控生成的皮质结构中，能增强神经元存活与成熟、促进轴突生长和血管整合，从而改善创伤性脑损伤后的修复效果。未来研究应进一步评估最佳的星形胶质细胞来源和移植时机，以优化治疗效果。
