《Advanced Science》：Farnesyltransferase Deficiency in Cardiomyocytes Initiates Senescence and Contributes to Cardiac Fibrosis
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本研究揭示了高脂环境下心肌细胞法尼基转移酶（FNTB）表达下调，通过损害核纤层蛋白A（LaminA）成熟、破坏核膜完整性，引发DNA损伤反应（DDR）和细胞衰老，进而促使衰老心肌细胞分泌Tgf-β2和Gdf-15等因子激活心脏成纤维细胞，最终导致心脏纤维化。该发现为理解脂毒性心肌病和代谢性心脏疾病的纤维化重构提供了新的分子机制和治疗靶点（如FNTB/Srebf2轴）。
心脏纤维化是心力衰竭进展的核心病理过程，由过度活化的成纤维细胞导致细胞外基质过度沉积，而心肌细胞可通过旁分泌信号调节这一过程。细胞衰老是一种由多种应激源触发的不可逆增殖停滞状态，伴随功能衰退和抗凋亡性。衰老细胞通过衰老相关分泌表型（SASP）主动释放细胞因子等物质，对邻近细胞产生深远的旁分泌效应。近年证据表明，衰老不仅发生在有丝分裂细胞中，也发生在心肌细胞等有丝分裂后细胞中。然而，心肌细胞衰老的上游触发因素及其与纤维化重构的机制联系仍不清楚。
胆固醇代谢失调深刻影响细胞衰老。法尼基化是一种与胆固醇代谢相关的翻译后修饰，依赖于甲羟戊酸途径衍生的法尼基焦磷酸（FPP）。法尼基转移酶β亚基（FNTB）是关键的催化组分。本研究发现，心肌细胞特异性Fntb基因敲除（cKO）小鼠会自发触发以纤维化为主要特征的心脏重构。在基础状态下，FNTB缺陷引发了以早发性间质纤维化为开端的渐进性心脏重构程序，纤维化在诱导后2周即可检测到，并在36周时达到三倍水平。这种胶原的显著积累与晚期舒张功能障碍的出现同步，从24周开始E/A比显著下降。与纤维化的快速发生相反，心肌细胞肥大延迟出现，心肌细胞横截面积增加在12周时才变得明显，心脏重量显著升高则从24周开始。值得注意的是，收缩功能在整个36周的观察期内保持显著正常，且未出现肺充血，表明这些小鼠维持在代偿性病理状态。在压力超负荷（TAC）模型中，Fntb-cKO小鼠表现出加速的功能恶化和显著的纤维化重构加剧，其功能障碍的加剧主要源于纤维化恶化，而非肥厚反应。
为了阐明心肌细胞FNTB缺陷与心脏重构（尤其是纤维化）相关的分子通路，研究人员对成年Fntb-cKO小鼠心肌细胞进行了RNA测序。加权基因共表达网络分析（WGCNA）揭示了三个与表型相关的模块，其中模块6相关性最强。通路富集分析显示，模块6中显著富集的通路主要涉及DNA损伤反应（DDR）、细胞周期蛋白调控和MAPK信号级联。与转录组预测一致，FNTB缺陷的心肌细胞表现出典型的DDR激活，包括Atm磷酸化增加、γH2AX病灶形成增多以及Chk1/Chk2激活。药理性抑制DDR可减轻FNTB缺失诱导的间质纤维化和心肌细胞肥大。这些发现表明，FNTB缺陷触发了心肌细胞的DDR，随后介导了观察到的关键心脏重构表型。
研究人员进一步探究了这种DDR激活下游的细胞命运。令人惊讶的是，尽管存在强烈的DDR，Fntb-cKO心肌细胞却表现出显著的抗程序性细胞死亡能力，Bax和cleaved Caspase-3水平稳定，TUNEL阳性细胞核频率可忽略不计。相反，观察到抗凋亡介质Bcl-2和Hsp70的意外上调。这些观察促使研究团队提出假设：FNTB缺失引发的DDR可能驱动心肌细胞走向细胞衰老而非凋亡。确实，在FNTB缺失后2周，观察到细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKIs）的mRNA表达增加，包括Cdkn1a、Cdkn2a和Tp53。随后，在基因缺失后12周，Fntb-cKO心脏经历了进行性的染色质重构，其特征是衰老相关异染色质 foci（SAHF）的积累，表现为H3K9me3阳性细胞核显著增加。心肌细胞的SA-β-Gal活性在基因缺失后24周也显著升高。这些发现，包括强烈的DDR激活、抗凋亡蛋白表达升高、CDKIs水平增加、SA-β-Gal活性增强以及心肌细胞肥大，共同表明FNTB缺陷诱导了心肌细胞衰老。
那么，FNTB缺失诱导的心肌细胞衰老如何机制性地导致心脏纤维化呢？首先，将来自Fntb-KO或WT小鼠培养的原代心肌细胞的条件培养基应用于原代WT心脏成纤维细胞。结果显示，来自KO心肌细胞的条件培养基显著增强了心脏成纤维细胞的活化、增殖、活力和细胞外基质分泌。SASP是指衰老细胞中分泌活性特征性增强的现象。此前WGCNA分析已发现，Fntb-cKO心肌细胞的模块6中SASP相关通路显著富集。从机制上讲，DDR诱导的SASP与Gata4的稳定化有关。研究首先证实了Fntb-cKO心肌细胞中Gata4蛋白水平增加。接下来，通过整合RNA测序和RT-qPCR分析，系统评估了候选SASP因子。其中，Tgfb2、Gdf15和Timp2的mRNA表达水平在FNTB缺失后的心肌细胞中显著升高。免疫印迹进一步证实了Fntb-cKO心肌细胞中Tgf-β2和Gdf15蛋白水平升高，而Timp2蛋白水平未变。ELISA检测同样证明，来自KO心肌细胞的条件培养基中Tgf-β2和Gdf15的分泌增加。为了确认这些因子的功能必要性，研究人员使用siRNA敲低了FNTB缺陷的心肌细胞中的Tgfb2或Gdf15。关键的是，中和条件培养基中的任一因子都显著削弱了其促纤维化作用，有效减弱了成纤维细胞活化和ECM相关基因的诱导。此外，在Fntb-cKO心脏中对CD45和F4/80进行免疫荧光染色，未发现显著的白细胞或巨噬细胞浸润，这表明观察到的纤维化并非主要由炎症细胞募集驱动，而是由心肌细胞到成纤维细胞的直接旁分泌信号传导所致。这些发现提供了令人信服的证据，表明心肌细胞中FNTB缺失诱导了以Tgf-β2和Gdf15产生和分泌增加为特征的DDR依赖性SASP，从而驱动心脏成纤维细胞活化并促进心脏纤维化。
最后，研究探讨了FNTB缺失导致DNA损伤和心肌细胞衰老的机制。核纤层蛋白A（LaminA）是一种核膜蛋白，与DDR有关，其成熟需要法尼基化。在缺乏法尼基化的情况下，LaminA以未加工的前体形式（prelaminA）保留。与此一致，对prelaminA的免疫荧光染色显示，Fntb-cKO心肌细胞中这种前体异常积累。总LaminA（检测成熟LaminA和prelaminA）染色显示，78%的细胞核中LaminA出现异常的核质重新分布，而WT细胞则呈现典型的周边定位。这种成熟缺陷是LaminA特异性的，因为LaminB1的亚细胞分布保持不变。透射电子显微镜揭示了FNTB缺陷心肌细胞细胞核的显著超微结构异常。FNTB敲除细胞核的核膜显得不规则且呈扇贝状，伴有核膜连续性的局灶性中断，同时电子致密物质疝入细胞质。这些核膜缺陷表明结构稳定性受损，已知会触发DDR激活。为了确定有缺陷的LaminA成熟是否是Fntb-cKO表型的主要驱动因素，研究使用了腺相关病毒血清型9（AAV9）来过表达一种成熟形式的LaminA（在氨基酸647处截短），它绕过了法尼基化依赖性加工的要求。值得注意的是，恢复成熟的LaminA改善了Fntb-cKO心脏特有的显著间质纤维化。尽管纤维化明显减轻，但在挽救时间范围内，心脏肥大以及整体收缩和舒张功能保持相对稳定。这些结果表明，心肌细胞特异性FNTB缺失损害了LaminA成熟并破坏了核膜的稳定性，这很可能是FNTB缺陷心脏中观察到的DDR的主要驱动因素。
考虑到法尼基化与胆固醇代谢之间的已知联系，研究进一步探究了脂质超载条件下FNTB的调控。在高脂饮食（HFD）喂养的小鼠中，观察到一种以间质纤维化、舒张功能障碍、持续性DNA损伤和衰老标志物诱导为特征的显著心脏表型。在这些小鼠中，心脏Fntb的mRNA和蛋白水平相较于普通饮食对照组显著降低，而Fnta表达保持不变。高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）分析显示，脂质超载后心脏FPP水平没有显著改变，排除了底物介导的反馈机制。这种抑制在胆固醇处理的原代心肌细胞中得以重现，棕榈酸（PA）也显示出部分抑制作用。重要的是，与正常血脂对照组相比，高脂血症患者的左心室乳头肌样本显示出FNTB蛋白水平降低。对公开的心脏RNA-seq数据的分析进一步扩展了这些观察结果。研究发现，与FNTB高表达组患者相比，FNTB低表达的射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）患者表现出心脏纤维化增加的趋势。此外，基因集富集分析（GSEA）表明，衰老基因集在FNTB低表达组中显著富集。
研究人员接下来探索了脂质诱导FNTB抑制的转录机制。通过对Fntb启动子进行整合生物信息学筛选，发现了12个候选转录因子，其中三个（Myc、Srebf和Ppar）是已知的脂质代谢调节因子。在胆固醇刺激的心肌细胞中进行实验验证，揭示了Ctcf、Pparg、Srebf1、Srebf2和Fntb转录本的协同下调，而其他候选因子则表现出不一致的表达模式。通过siRNA敲低进行功能探究显示了特异性——沉默Srebf2使Fntb蛋白减少37%，而靶向Ctcf、Pparg或Srebf1则没有效果。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实了Srebf2在Fntb启动子处的结合。此外，双荧光素酶报告基因检测证明，Srebf2增加了293T细胞中Fntb启动子的转录活性。
最后，研究评估了恢复Srebf2-Fntb轴是否能减轻脂质超载诱导的心脏重构，使用了AAV9介导的过表达策略。值得注意的是，AAV9-Fntb递送显著改善了HFD喂养小鼠的舒张功能，表现为E/A比恢复正常，并显示出间质纤维化减轻的明显趋势。相比之下，Srebf2过表达未能挽救这些病理参数，可能是由于其复杂的下游代谢效应或额外的脂质诱导抑制信号。与先前的观察一致，无论是Fntb还是Srebf2干预都没有显著影响心肌细胞肥大或收缩功能。这些发现确定了FNTB的抑制是代谢应激下舒张功能和纤维化的关键驱动因素。
总之，本研究结果证明，脂质超载通过SREBF2介导的转录抑制降低了心肌细胞FNTB表达，随后减少了法尼基化。心肌细胞衰老在心脏重构中起着关键作用，但其调控机制仍不清楚。本研究结果确定了FNTB是心肌细胞衰老的关键调控因子。暴露于高脂环境会减少心肌细胞中的法尼基化，损害LaminA成熟并诱导DNA损伤反应。这进而触发了以分泌促纤维化因子（如Tgf-β2和Gdf-15）为特征的过早心肌细胞衰老，促进成纤维细胞活化和心脏纤维化。这些发现揭示了受损的法尼基化与心肌细胞衰老之间的新联系，为与血脂异常相关的心脏重构提供了机制性见解。尽管存在这些见解，本研究也存在一些局限性。首先，虽然提出衰老心肌细胞及其SASP驱动纤维化表型，但并未通过在体内选择性消除衰老细胞来直接证明因果关系。其次，需要对慢性应激下心肌细胞特异性FNTB缺陷进行更长期的研究，以充分了解其衰老轨迹。第三，关于转化相关性，在高脂血症患者的心脏组织中观察到FNTB表达降低；然而，必须谨慎地将小鼠的机制发现直接外推到人类病理学。
