《Advanced Science》：Atrophic Skeletal Muscle-Derived Extracellular Vesicles Transfer miR-125a-5p to Inhibit Bone Formation in Osteoporosis during Aging
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本研究揭示了一条全新的肌-骨内分泌轴，证实衰老过程中萎缩的骨骼肌释放的细胞外囊泡（EVs）增多，并靶向运输至骨组织，其携带的miR-125a-5p通过抑制前成骨细胞中Sirt7（SIRT7）的表达，进而干扰Sp7（SP7/Osterix）转录，最终抑制骨形成。该发现不仅阐明了肌少症相关骨质疏松的新机制，也为开发同时治疗肌萎缩和骨丢失的靶向疗法提供了新思路。
2.1 衰老过程中萎缩骨骼肌来源的细胞外囊泡增多并被成骨细胞摄取
衰老常导致骨骼肌萎缩与骨质疏松并存，其核心问题是成骨细胞功能受损导致的骨形成下降。研究发现，随着小鼠年龄增长，其比目鱼肌（SOL）纤维横截面积（CSA）和收缩功能进行性下降，伴随骨量减少和成骨细胞功能受损。肌肉纤维CSA与骨密度（BMD）及成骨细胞表面占骨表面积比值（Ob.S/BS）呈显著正相关，提示衰老中肌肉萎缩与骨丢失紧密关联。机制上，促进外泌体分泌的关键蛋白RAB27A在萎缩肌肉纤维中的表达随衰老显著增加。透射电镜（TEM）显示老年小鼠肌肉组织中管腔内囊泡（ILVs）数量增多，纳米颗粒跟踪分析（NTA）也证实来自老年肌肉组织的EVs丰度更高。这些EVs表达经典标记物CD9、CD63、CD81和TSG101。通过构建骨骼肌特异性Cd63-eGFP报告基因小鼠（HSACre;Cd63(loxp-eGFP)），研究人员在体内直接追踪到，衰老过程中肌肉纤维特异性EVs生成增多，并可通过血液循环被骨组织中的成骨细胞摄取，其在成骨细胞中的信号随年龄增长而增强。
2.2 通过GW4869特异性阻断骨骼肌中的细胞外囊泡生成可缓解老年小鼠的骨丢失
为了探究抑制肌肉EV生成对骨形成的影响，研究开发了RGDLTTP肽修饰的脂质体（R-LS）用于骨骼肌靶向递送EV生成抑制剂GW4869（R-LS-GW4869）。体内成像证实该脂质体系统对骨骼肌具有高度选择性。对老年小鼠进行为期6周的R-LS-GW4869静脉注射治疗后，肌肉来源的EVs显著减少。微计算机断层扫描（micro-CT）分析显示，治疗组小鼠股骨远端的骨微结构改善，骨密度（BMD）和骨小梁数量（Tb.N）升高，骨小梁分离度（Tb.Sp）降低。钙黄绿素双标显示矿化沉积率（MAR）增加，骨钙素（OCN）免疫组化染色显示成骨细胞表面增多。体外实验中，将前成骨细胞与对照肌管、萎缩肌管或经GW4869预处理的萎缩肌管共培养。结果显示，与萎缩肌管共培养会抑制前成骨细胞中成骨相关基因（Collagen1α1, Runx2, Alpl, Ocn）的表达和碱性磷酸酶（ALP）活性，而这种抑制作用可被GW4869预处理所逆转。
2.3 衰老骨骼肌来源的细胞外囊泡在体内外抑制骨形成和成骨分化
将老年小鼠来源的衰老骨骼肌EVs（Aged-SKM-EVs）定期静脉注射给年轻小鼠，持续6周。结果显示，PKH26标记的Aged-SKM-EVs可被年轻小鼠股骨中的成骨细胞有效内化。Micro-CT分析表明，注射Aged-SKM-EVs的小鼠股骨远端BMD、Tb.N和骨小梁厚度（Tb.Th）降低，Tb.Sp增加。钙黄绿素双标显示MAR降低，OCN染色显示成骨细胞活性下降。在体外，用Aged-SKM-EVs处理前成骨细胞，可显著抑制成骨相关基因的mRNA和蛋白表达，并降低ALP活性。同样，用萎缩肌管来源的EVs（ATR-EVs）处理前成骨细胞系MC3T3-E1，也观察到对成骨分化的抑制效应。
2.4 miRNA介导了衰老骨骼肌来源的细胞外囊泡对老年小鼠骨形成的抑制作用
鉴于miRNA是EVs调控受体组织功能的关键效应分子，研究通过向老年Dicerfloxp/floxp小鼠注射肌肉肌酸激酶（MCK）启动子驱动的Cre腺相关病毒（AAV），实现了骨骼肌特异性敲除miRNA生物合成关键酶Dicer。结果显示，肌肉特异性Dicer敲除（DicermKO）显著改善了老年小鼠的骨微结构，提高了MAR和Ob.S/BS，而肌肉纤维形态未受影响。这表明Aged-SKM-Es中携带的miRNAs介导了其对成骨作用的抑制。
2.5 miR-125a-5p在肌少症患者血浆细胞外囊泡中富集并介导对成骨分化的抑制
通过对非肌少症和肌少症老年患者的血清EVs进行小RNA深度测序，并结合萎缩肌管来源EVs（ATR-EVs）的测序数据，筛选出miR-125a-5p和miR-222-3p为共同上调的miRNA，其中miR-125a-5p丰度更高。qPCR验证证实，miR-125a-5p在肌少症患者的肌肉组织、老年小鼠的肌肉组织、Aged-SKM-Es、老年小鼠血清EVs以及萎缩肌管及其来源EVs中均显著上调。在功能上，在共培养体系中加入miR-125a-5p抑制剂，可以逆转ATR-EVs对前成骨细胞成骨分化的抑制作用，恢复成骨基因表达和ALP活性。
2.6 功能获得与缺失实验证实骨骼肌中的miR-125a-5p在衰老过程中抑制骨形成
利用肌肉靶向肽（RGDLTTP）修饰的重组腺相关病毒（MyoAAV）载体，在老年小鼠骨骼肌中特异性过表达或沉默miR-125a-5p。结果表明，肌肉特异性过表达miR-125a-5p会加剧肌肉萎缩，并导致股骨远端BMD、Tb.N、Tb.Th下降，Tb.Sp升高，MAR和Ob.S/BS降低。相反，利用“海绵”（sponge）载体沉默肌肉中的miR-125a-5p，则能促进骨形成，缓解年龄相关的骨丢失和肌肉萎缩。在年轻小鼠中过表达miR-125a-5p也重现了诱导肌萎缩和抑制骨形成的表型。
2.7 miR-125a-5p通过靶向SIRT7介导的Sp7去乙酰化抑制成骨分化并阻碍骨形成
在机制层面，研究发现miR-125a-5p能直接抑制前成骨细胞中Sirt7的表达。双荧光素酶报告基因实验证实，miR-125a-5p可直接结合Sirt7mRNA的3‘非翻译区（3’-UTR）。过表达miR-125a-5p会显著抑制成骨分化，而共转染Sirt7过表达质粒则可逆转此抑制效应。进一步研究揭示，SIRT7能直接结合并去乙酰化Sp7基因启动子区域，从而促进Sp7的转录。过表达Sirt7能上调Sp7mRNA水平，而使用去乙酰化酶抑制剂则会抑制Sp7的转录。因此，miR-125a-5p通过靶向抑制Sirt7，破坏了SIRT7介导的对Sp7启动子的组蛋白去乙酰化作用，最终导致Sp7转录活性下降和成骨分化受损。
3 讨论
本研究系统阐明了一条在衰老过程中由萎缩骨骼肌主动抑制骨形成的全新内分泌通路。衰老骨骼肌释放的EVs增多，通过循环系统靶向骨组织，并将其携带的关键miRNA货物——miR-125a-5p递送至成骨谱系细胞。miR-125a-5p通过直接靶向抑制Sirt7，干扰了SIRT7依赖的Sp7启动子去乙酰化和转录激活，从而抑制成骨分化，导致骨形成减少和骨丢失。这一轴线的发现，不仅深化了对肌少症与骨质疏松共病机制的理解，也提示靶向Aged-SKM-EVs或miR-125a-5p-SIRT7-SP7通路，可能成为同时治疗肌肉萎缩和骨质疏松的潜在新策略。研究的局限性包括未完全解析EVs中的其他衰老相关因子、临床样本仅包含男性、以及GW4869对EV亚群抑制的非特异性等，未来研究需在这些方面进行深入探索。
