《Journal of Proteome Research》：High-Throughput Proteomics Sample Preparation Using a 96-Channel Pipettor and Magnetic Pin Device
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本研究为解决磷酸化蛋白质组学（PTM profiling）等高通量蛋白质组学样品处理流程复杂、成本高昂且难以完全自动化的问题，开发了一种基于手动操作的96通道设备（Gilson Platemaster P220移液器和VP Scientific 96孔磁性针装置）的实用中间方案。研究人员通过优化蛋白质聚集捕获（PAC/SP3）消化、脱盐、磷酸化肽段富集等步骤，在2天内实现了96孔板格式下稳健且可重复的磷酸化蛋白质组学分析，显著减少了操作者的工作量与变异。该工作流程引入了低成本自制Oasis HLB固相萃取板和简化的PAC消化方法，为实验室向全自动化过渡提供了有效桥梁。
在当今生命科学领域，基于质谱的蛋白质组学技术正在经历一场深刻的变革。新一代质谱平台能够在极短时间内鉴定和定量成千上万的蛋白质，这为大规模生物学和临床研究带来了前所未有的机遇。然而，一个棘手的瓶颈也随之浮现：样品处理。在质谱分析之前，来自细胞、体液或组织的蛋白质样本需要经过提取、还原烷基化、酶切、脱盐等一系列繁琐步骤，才能转化为适合上机的纯净肽段。对于像磷酸化蛋白质组学这样的翻译后修饰研究，流程更是复杂，通常还需要额外的富集步骤。尽管自动化液体处理工作站理论上可以解放人力并提高重复性，但其高昂的购置和维护成本、复杂的编程需求，让许多实验室望而却步。那么，是否存在一种既高效、稳定，又相对经济、易于上手的高通量样品处理方案呢？
一篇发表在《Journal of Proteome Research》上的研究，为我们提供了一份极具参考价值的“中间路线图”。研究人员另辟蹊径，没有追求一步到位的全自动化，而是巧妙地利用了两款手动操作的96通道设备——Gilson Platemaster P220移液器和VP Scientific的磁性针（MagPin）装置，构建了一套完整的96孔板格式磷酸化蛋白质组学工作流程。他们的目标很明确：在保证数据质量（稳健性和可重复性）的前提下，大幅提升处理通量，减少人工操作时间和塑料耗材浪费，并为未来迈向全自动化铺平道路。
为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键技术方法。核心是使用96通道手动移液器进行高通量液体处理和磁珠操作，并配套使用磁性针装置进行磁珠的精准转移。样品处理基于蛋白质聚集捕获（Protein Aggregation Capture, PAC，也称SP3）技术，利用羟基磁珠沉淀并捕获蛋白质。关键的脱盐步骤采用了团队自行开发的方法，将Oasis HLB固相萃取材料直接填装到锥形滤板中，制成低成本的自填装96孔脱盐板。磷酸化肽段的富集则使用了锆离子固定化金属亲和色谱（Zr-IMAC HP）磁珠。最终的肽段分析通过纳升液相色谱与高分辨质谱联用（LC-MS）在数据非依赖采集（DIA）模式下完成。研究所用的样本包括THP-1人单核细胞系、大肠杆菌（E. coli）和酿酒酵母（S. cerevisiae）的裂解液，并按特定比例混合成三物种混合样本用于方法学评估，此外还使用了人脂肪组织条件培养基样本。
研究结果部分，作者通过一系列实验对工作流程的各个环节进行了深入优化和评估。
引入自填装Oasis HLB板
针对商业固相萃取（SPE）板在样品数非96整数倍时成本高昂的问题，研究者开发了将散装Oasis HLB材料直接填入滤板的方法，大幅降低了单板成本（约25美元）。他们发现，每毫克Oasis HLB材料会保留约1.3μL的水相溶液，这一特性对于精确控制后续磷酸化富集步骤的乙腈（ACN）浓度至关重要。
脱盐应在1:100的肽段-吸附剂比例下进行
通过测试不同上样量，研究者确定当Oasis HLB材料与肽段的质量比达到100:1时，流穿（未被保留）的肽段信号趋于稳定，表明此时材料负载充足，可作为标准脱盐比例。
Oasis HLB材料在去除脂质污染方面效果不佳
在分析富含脂质的脂肪组织条件培养基时，研究者发现肽段在35% ACN浓度下即可被完全洗脱，但脂质污染物也在相近浓度下被洗脱，表明无法通过调节ACN浓度在该材料上实现肽段与脂质的高效分离。
Oasis HLB材料在高pH值分馏中逊于C18
尝试用Oasis HLB材料进行高pH反相分馏时，研究者发现肽段洗脱过早，且各馏分间重叠严重，仅约30%的肽段为单一馏分独有，其分馏正交性不如传统的C18材料。
使用96通道设备的磷酸化蛋白质组学流程
研究详细展示了整合PAC消化、脱盐、磷酸化富集及二次脱盐的完整工作流程。其中，磷酸化富集后必须进行二次脱盐，因为直接进样会导致色谱性能快速下降。
PAC中的消化可通过短暂移液完成
一个关键发现是，PAC消化无需在振荡器上持续悬浮磁珠过夜。实验证明，仅需将磁珠在蛋白酶溶液中抽吸混匀2分钟，然后静置过夜，即可实现高效消化。过夜振荡反而会引入更多变异。这简化了自动化步骤，消除了对加热振荡器的需求。
使用三物种混合物对PAC和磷酸化蛋白质组学进行基准测试
为评估流程性能，研究者制备了不同比例的大肠杆菌、酿酒酵母和人类（THP-1）蛋白质混合物样本。主成分分析（PCA）显示，总蛋白质和磷酸化位点的定量结果能准确反映样本的预设比例。定量变异系数（CV）分析表明，该样品处理流程本身在蛋白质水平贡献了约1-2%的CV，在磷酸化位点水平贡献了约2-3%的CV，展现了出色的重复性。
在结论与讨论部分，研究者强调，他们所描述的方法并非要替代功能全面的自动化液体处理工作站，而是为有意向实现全自动化的实验室提供一个优秀的“垫脚石”。这套基于96通道手动设备的工作流程具有多重优势：首先，它显著提高了处理通量，能在2天内完成96个样本的磷酸化蛋白质组学制备；其次，通过专用枪头避免交叉污染并重复使用，大幅减少了塑料耗材；再者，整个系统搭建成本低于2万美元，且协议易于执行，无需专门的液体处理编程培训。研究中的几项创新点具有广泛的应用价值，例如低成本自制Oasis HLB板解决了小规模实验的成本痛点，而“短暂移液消化法”的验证则简化了PAC流程的自动化设计。通过与文献中其他自动化或半自动化方法的比较，本工作流程在定量重复性方面表现优异。最后，作者建议在未来的方法学开发研究中纳入混合样本（pooled sample），以便更好地区分样品制备变异和LC-MS分析变异，这为领域内的标准化评估提供了重要参考。总之，这项研究为高通量蛋白质组学，特别是磷酸化蛋白质组学的样品制备，提供了一套高效、稳健、经济且用户友好的实用方案，有效地弥合了手动操作与全自动化之间的鸿沟。
