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本文首次报道了利用流式细胞术结合成像流式细胞术，在完整的人类诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经祖细胞（NPC）上，通过共标记轴丝（ARL13B）和基底体（PCNT）标志物，实现了对纤毛化细胞的客观、定量检测。该方法成功应用于比较纤毛病（CPLANE1突变）患者与健康对照来源的神经祖细胞，证实其能有效区分纤毛频率变化，为纤毛相关疾病（如神经发育障碍）的研究提供了一种可扩展的、高精度的新工具。
引言
初级纤毛是广泛存在于多种细胞类型（如脂肪细胞、软骨细胞、神经祖细胞）表面的突出细胞器，在细胞信号传导中发挥关键作用。其形成和功能缺陷与多种病理状况相关，包括神经发育缺陷、衰老和癌症。传统上，对细胞样本中纤毛化细胞的评估依赖于荧光/共聚焦显微镜下对免疫标记纤毛标志物后的视觉评估和计数。尽管已有先进的图像分析工具来协助这一费力的评估，但该方法仍可能受操作者依赖性因素的影响，且可计数的细胞数量有限。本研究探索了一种替代方法——利用流式细胞术和成像流式细胞术来分析携带纤毛的人类神经祖细胞。
材料与方法
研究使用了从野生型人iPSC系和携带CPLANE1突变的iPSC系分化产生的神经祖细胞。细胞培养于玻片或悬浮液中，通过免疫荧光染色标记纤毛标志物。使用的关键抗体包括针对轴丝标志物ARL13B和基底体标志物PERICENTRIN（PCNT）的一抗及相应的荧光二抗。为验证方法特异性，还使用了另一纤毛相关标志物INPP5E。为诱导纤毛减少，部分细胞用10 mM CaCl2处理20分钟。
分析采用了三种方式：1）传统的荧光显微镜观察（使用Leica SP8或DM6B显微镜）和基于ImageJ的手动计数；2）流式细胞术分析（使用BD FACS Lyric或BD FACS Aria III流式细胞仪），数据用Floreada软件分析；3）成像流式细胞术分析（使用Amnis ImageStreamX Mark II），以提供空间分辨率确认信号定位。
结果
首先，研究测试了使用抗ARL13B抗体（绿色荧光）通过流式细胞术检测纤毛化细胞的可行性。结果显示，流式细胞仪能清晰检测到阳性细胞群体，与仅二抗对照相比信号明显偏移。通过成像流式细胞术和细胞离心涂片后的显微镜观察，确认了该信号特异性定位于细胞膜上的纤毛，与传统显微镜在贴壁培养中观察到的模式一致。
接着，研究结合了ARL13B（轴丝标志物）和PCNT（基底体标志物）进行双重标记。双重标记在传统免疫荧光和流式细胞术中均产生清晰可见的阳性信号。成像流式细胞术进一步证实，两个标志物的信号共定位于细胞膜上的单个斑点。所有ARL13B+的细胞均为PCNT+，而部分PCNT+细胞为ARL13B?，这与显微镜观察结果一致，并确认了ARL13B是纤毛检测更具区分性的标志物。使用ARL13B和INPP5E的共同染色也验证了纤毛检测的特异性。
为验证方法的检测能力，研究比较了未经处理的对照细胞和经CaCl2处理（已知可降低纤毛化细胞百分比）的细胞。流式细胞术分析显示，处理样本的纤毛化细胞比例确实低于对照，该结果与对同一样本进行的显微镜分析结果一致（处理后分别降低15%和22%）。
最后，该方法被用于分析来自CPLANE1基因突变（与Joubert综合征相关）iPSC的神经祖细胞，并与健康对照进行比较。流式细胞术分析显示，CPLANE1突变细胞系的纤毛化细胞比例与对照相比显著降低，这与此前基于AcTUBULIN和PCNT免疫染色的研究观察相符。
讨论
传统的纤毛化细胞频率测量依赖于视觉评估和计数，耗时且易受操作者变异影响。近年来虽有半自动化图像分析方法的报道，但仍需采集大量图像，且对高密度簇状生长的神经祖细胞培养物而言，精确的纤毛成像和分割存在挑战。
本研究首次成功利用流式细胞术检测并分析了完整、纤毛化的人类神经祖细胞群体。通过使用抗ARL13B和抗PCNT抗体分别标记轴丝和基底体，并利用成像流式细胞术确认信号特异性，首次证明了这种基于单细胞的检测模式适用于纤毛化细胞群体的评估。ARL13B标记比中心粒相关的PCNT更具区分性，且对轴丝特异。
与传统的基于显微镜的纤毛计数方法相比，流式细胞术在样本通量和测量准确性方面具有显著优势。每个样本可通过流式细胞术评估的细胞数量比现有显微镜方法高出几个数量级，从而提供更具代表性的数据。对大量细胞样本进行荧光信号的客观测量，克服了在选定视野内视觉计数纤毛所固有的操作者依赖性偏差。因此，流式细胞术的速度和高通量特性特别适合于量化大细胞样本中的纤毛化细胞频率，以获得统计可靠的数据集。此外，流式细胞术可同时测量多个荧光通道，为结合表型、增殖或细胞周期标志物（如细胞周期蛋白、Ki67、PCNA）以及其他与荧光读数兼容的细胞状态标志物（例如衰老或凋亡测定）来进一步表征纤毛化亚群提供了可能。
流式细胞术分析的样本可并行制备细胞离心涂片，为纤毛染色的特异性和表型提供互补的定性对照。或者，使用成像流式细胞术可以增加精确的空间分辨率，提供即时的信号定性验证。这种先进模式可能特别有利于寻找新的纤毛发生调节剂的药物筛选，并可为使用纤毛化细胞测量评估神经发育疾病表型的临床前研究提高通量。特别是，基于纤毛病患者样本体外模型的转化研究，可以利用这种标准流式细胞仪设置即可实现的单细胞流式模式。通过流式细胞术识别并可能分选纤毛化细胞以进行进一步表征的能力，将可能促进神经发育疾病研究的新实验策略和建模。
结论
本研究结果首次证明，流式细胞术可用于以定量、高通量、操作者非依赖性的模式检测神经祖细胞上的初级纤毛，为简化和改进纤毛化细胞群体的研究开辟了新的可能性。
