《Aggregate》：Click Chemistry and Bioorthogonal Reaction for Aggregation-Induced Emission Bioconjugates
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本文系统评述了通过点击化学（如CuAAC、SPAAC）和生物正交反应构建聚集诱导发光（AIE）生物偶联物的最新进展。文章聚焦于此类偶联物在生物传感、生物成像及图像引导治疗等生物医学领域的创新应用，并探讨了金属催化与无金属点击策略各自的优势。文中强调，AIE发光原（AIEgen）与生物活性分子的特异性结合，实现了高灵敏度、高选择性的检测与可视化，为疾病诊断和靶向治疗提供了强有力的工具。本综述旨在促进多功能AIE生物偶联物的开发，并启发生物正交化学在生物医学领域的进一步创新。
在生物医学研究领域，如何对生物分子进行特异性标记和可视化，一直是科学家们致力攻克的关键技术。传统荧光染料在高浓度或聚集状态下常发生荧光淬灭，这一难题限制了其在复杂生物环境中的应用。然而，一类被称为聚集诱导发光（Aggregation-Induced Emission， AIE）的材料打破了这一局限。AIE发光原（AIEgen）在分散状态下荧光微弱，但在聚集状态下荧光显著增强，且具有优异的光稳定性，这使其成为生物成像和生物传感的理想候选者。将AIEgen与具有生物活性的分子（如糖、肽、蛋白质、核酸）精准连接，形成AIE生物偶联物，便能赋予这些材料高度的靶向特异性与检测灵敏度。实现这种精准连接的两大核心工具便是点击化学和生物正交反应。
点击化学用于AIE生物偶联物
点击化学以其高效、高选择性和条件温和著称，是构建功能化生物偶联物的强大手段。根据是否使用金属催化剂，可将其分为金属催化点击反应和无金属点击反应，两者在AIE生物偶联物的构建中各显神通。
生物传感
在生物传感方面，AIE生物偶联物展现了卓越的性能。例如，通过铜(I)催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC），将AIEgen与乳糖片段连接，所得偶联物可特异性识别霍乱毒素B亚基，实现荧光“开启”式检测。同样，将AIEgen与凋亡相关的肽段（如DEVD）连接，可构建用于实时监测细胞凋亡过程中caspase-3/-7酶活的探针。此外，通过点击反应将AIEgen与靶向整合素αvβ3的cRGD肽连接，不仅能定量检测溶液中的整合素，还能实时成像其在细胞膜上的结合过程。
核酸检测也从中受益。通过CuAAC或应变促进的叠氮-炔环加成反应（SPAAC），将AIEgen与单链DNA连接，可构建高特异性DNA探针。当与互补靶标DNA杂交时，探针构象受限，AIE效应被激活，产生强烈的荧光信号，甚至能区分单碱基突变。基于此原理开发的探针，结合核酸外切酶III（Exo III）辅助的靶标循环放大策略，能够实现端粒酶活性或特定microRNA的高灵敏度检测。
无金属点击反应，如SPAAC、硫(VI)氟交换反应（SuFEx）以及自发氨基-炔点击反应，因其更好的生物相容性而在活体传感中更具优势。例如，通过SPAAC反应构建的AIE-DNA探针，可在10分钟内高选择性、高灵敏度地检测循环肿瘤DNA（ctDNA）。而基于SuFEx点击反应合成的聚硫酸酯功能化AIE材料，则能通过阴离子-π相互作用选择性识别水中的氰根离子。
生物成像
AIE生物偶联物在生物成像，尤其是靶向成像方面表现出巨大潜力。通过点击化学将AIEgen与肿瘤靶向肽（如靶向LAPTM4B蛋白的AP2H肽）连接，可实现癌细胞的高对比度实时成像。更精妙的策略是设计双靶向肽偶联的多功能探针，使其能够同时识别肿瘤微环境中过表达的两种标志物（如CD13和整合素αvβ3），从而实现细胞核的高保真靶向和长时程追踪。
无金属催化点击反应，特别是活化的炔基与生物分子表面天然氨基的自发点击反应，为生物偶联提供了更便捷的途径。利用这一策略，研究者成功将多色AIEgen共价修饰到天然蚕丝上，获得了发光稳定、色彩丰富的荧光丝材料，可用于细胞追踪和组织工程支架监测。该策略还可用于标记活体细胞器，如将AIEgen共价连接至植物叶绿体，利用其光转换特性提升光合作用效率；或用于长时间追踪神经元中线粒体的动态运动。
此外，硫醇-烯点击反应也被广泛用于纳米颗粒（NPs）的表面功能化，以实现靶向成像。例如，将马来酰亚胺修饰的AIE纳米颗粒与半胱氨酸修饰的细胞穿膜肽（如HIV-Tat肽）偶联，可显著提升纳米颗粒的细胞穿透效率和细胞内滞留时间，用于深层组织双光子成像或干细胞分化过程监测。
图像引导治疗
AIE生物偶联物的价值不仅在于“看见”，更在于“治疗”。通过合理的分子设计，AIEgen本身可作为高效的光敏剂，在光照下产生活性氧（ROS），实现光动力治疗（PDT）。将其与靶向单元结合，便能实现图像引导的精准治疗。
例如，通过CuAAC反应将AIE光敏剂与甘露糖偶联，所得的偶联物可特异性靶向肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），在实现TAMs特异性成像的同时，通过光照产生ROS对其进行精准消融。针对细菌感染，研究者设计了可被细菌代谢并入肽聚糖的AIE探针。该探针在细菌内聚集发光，实现细菌定位，并在光照下原位产生ROS，在不伤害宿主细胞的情况下清除胞内细菌。
无金属点击反应在治疗领域展现出独特的优势。活化的炔基功能化AIE光敏剂可与肿瘤细胞内的蛋白质发生点击反应，消耗还原性物质并引发氧化应激，结合PDT效应，能有效杀伤肿瘤细胞并激活抗肿瘤免疫。更有趣的是，研究者实现了在活细胞内的无金属氨基-炔点击聚合，原位生成的AIE聚合物不仅可用于成像，还能干扰细胞骨架，为无药抗癌提供了新思路。
AIE生物偶联物的生物正交反应
生物正交反应是点击化学在生命体系中的深化与发展，要求反应官能团在生物体内不存在、不干扰正常生理过程，且反应快速、高效。除了前述的SPAAC，逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应（inverse electron-demand Diels-Alder， iEDDA）是另一类重要的生物正交工具。
生物成像
结合代谢糖工程技术，可让肿瘤细胞表面表达外源的叠氮基团。随后，注入带有环辛炔（如DBCO）基团的AIE纳米点（AIE-dots），两者通过无金属点击反应在肿瘤部位特异性结合，实现肿瘤的高对比度靶向成像。基于四嗪的荧光探针因其“猝灭-点亮”特性备受关注。四嗪本身是高效的荧光猝灭剂，当其与AIEgen结合时，背景荧光极低；在与反式环辛烯（TCO）等亲双烯体发生iEDDA反应后，四嗪被消耗，AIEgen的荧光恢复并因其聚集而大大增强，实现了超高信噪比的生物正交成像，可用于活细胞多细胞器标记。
图像引导治疗
生物正交反应为实现诊疗一体化提供了精准的“化学手术刀”。一种策略是“预靶向-点击”治疗：先通过代谢工程使肿瘤细胞表达叠氮基团；然后注射带有DBCO基团的AIE光敏剂纳米颗粒，两者在肿瘤部位发生生物正交反应，实现光敏剂的定点富集；最后进行光照，实施局部PDT。这种策略显著提高了治疗的靶向性和效率。
更先进的系统整合了生物正交激活与智能自组装。例如，一种双靶向肽可在肿瘤细胞膜上被碱性磷酸酶（ALP）去磷酸化后自组装成纳米纤维，暴露出大量的DBCO基团。随后，注入带有叠氮基团的AIE光敏剂，通过点击反应被招募并富集在细胞膜上。聚集的AIE光敏剂不仅发出强烈荧光用于成像，还能在光照下高效产生I型ROS，诱发肿瘤细胞发生gasdermin E（GSDME）介导的焦亡，并激活抗肿瘤免疫反应。另一种协同策略是利用四嗪与TCO之间的iEDDA反应，同时激活AIE光敏剂的荧光和释放前药（如阿霉素前药），实现化疗与PDT的协同，并结合免疫治疗，有效抑制原发瘤和远端转移瘤。
总结与展望
总而言之，点击化学与生物正交反应为AIE生物偶联物的精准构建提供了强大而灵活的“分子连接器”。这些先进的生物偶联物在生物传感、成像和图像引导治疗领域已取得了一系列突破性成果，展现了极高的应用价值。未来，开发反应速率更快、生物相容性更佳的新型点击/生物正交反应，设计与合成亮度更高、波长更适宜活体应用的新型AIEgen，以及构建更智能、更复杂的级联响应或多模式协同治疗体系，将是该领域发展的主要方向。随着研究的不断深入，AIE生物偶联物有望在疾病早期诊断、精准治疗和基础生命科学研究中发挥越来越重要的作用。
