《Biochemistry Research International》：Identifying Prognostic Biomarkers and Key Pathways in Renal Clear Cell Carcinoma: A Pilot Study Using Integrated miRNA and Gene Expression Analysis
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本综述通过整合miRNA与mRNA表达谱分析，系统鉴定了肾透明细胞癌（RCCC）中关键的预后生物标志物（如miR-26a-1-3p， CDK1， RUNX2）和失调的信号通路（如PI3K–Akt， MAPK）。研究揭示了miRNA-hub基因调控轴（如miR-26a-1-3p/RUNX2）在RCCC发生发展中的潜在作用，为理解其分子机制、开发预后工具及寻找新治疗靶点提供了重要见解。
引言
肾透明细胞癌（RCCC）是肾细胞癌（RCC）中最常见且侵袭性强的亚型，约占所有RCC病例的85%，其高发病率、高死亡率及对常规治疗反应不佳构成了重大的健康负担。RCCC起源于近曲小管上皮细胞，其分子特征复杂，包括3p缺失和VHL肿瘤抑制基因失活等拷贝数改变。为了改善患者预后，识别准确的预后生物标志物和治疗靶点至关重要。MicroRNAs（miRNAs）作为短链非编码RNA，在基因转录后调控中扮演关键角色，其失调与肿瘤发生发展密切相关，因此成为癌症生物标志物研究的 promising candidate。
材料与方法
本研究利用公共基因表达数据，对9例RCCC组织和11例正常肾组织进行了miRNA谱比较分析。通过GEO2R工具，以错误发现率（FDR）< 0.01和绝对log2倍数变化（|log2FC|）> 1.585为阈值，鉴定出差异表达miRNA（DEMs）。利用miRWalk 2.0和miRTarBase数据库预测并验证DEMs的靶基因，同时从DisGeNET数据库获取已知的RCCC相关基因。将两组基因取交集，得到RCCC相关基因集。随后，使用STRING数据库构建蛋白互作网络（PIM），并导入Cytoscape进行可视化与分析。通过计算度中心性和中介中心性，筛选出枢纽基因（hub genes）。利用MCODE插件识别网络中的关键模块（cluster）。功能富集分析通过g:Profiler工具进行，涵盖基因本体（GO）术语（包括生物过程BP、分子功能MF、细胞组分CC）和KEGG等信号通路。预后分析方面，使用GEPIA2数据库评估枢纽基因与RCCC患者总生存期（OS）的关系，并使用Kaplan–Meier plotter评估DEMs的预后价值。通过UALCAN数据库验证DEMs在肿瘤与正常组织中的表达差异。此外，利用GEO数据集GSE76351和TCGA–KIRC队列（通过Kaplan–Meier plotter）独立验证关键枢纽基因（CDK1， RUNX2）的表达及预后意义。通过starBase数据库分析关键miRNA与枢纽基因之间的表达相关性。最后，研究收集了5例肾癌和5例正常肾组织样本，通过实时定量PCR（RT-PCR）验证RUNX2的表达。
结果
1. RCCC中的差异表达miRNA
分析共鉴定出15个DEMs，其中9个上调，6个下调。上调的miRNA包括hsa-miR-542-5p（FC=20.535）、hsa-miR-144（FC=4.469）等；下调的miRNA包括hsa-miR-26a-1（FC=0.301）、hsa-miR-377（FC=0.089）等。
2. 模块、枢纽基因、通路与GO术语
通过数据库交集获得了424个RCCC相关基因。基于此构建的PIM网络包含396个蛋白和3704个互作。从中筛选出74个枢纽基因，其中度中心性最高的包括TP53、AKT1、MYC、EGFR、SRC等。MCODE分析识别出三个重要的基因子网络（Cluster 1-3），其中Cluster 1包含56个基因，互作边数最多（522条）。
通路富集分析显示，“癌症通路”（Pathways in cancer）、“PI3K–Akt信号通路”（PI3K–Akt signaling pathway）和“MAPK信号通路”（MAPK signaling pathway）是RCCC恶性转化中最显著失调的信号通路。在生物过程（BP）层面，“程序性细胞死亡调控”（Regulation of programmed cell death）、“信号转导调控”（Regulation of signal transduction）和“凋亡过程调控”（Regulation of apoptotic process）最为富集。细胞组分（CC）中，“细胞质”（Cytoplasm）和“细胞外围”（Cell periphery）受影响最大。分子功能（MF）方面，“蛋白结合”（Protein binding）和“酶结合”（Enzyme binding）最为显著。
3. 预后标志物
生存分析表明，CRP、CDK1和RUNX2的过表达是RCCC的不良预后标志物。其中CRP的风险比（HR）最高，为1.8。这三个基因的组合（CRP+CDK1+RUNX2）也显示出预后价值（HR=1.7）。相反，ERBB2、IGF1R等38个基因被鉴定为有利的预后标志物。对于miRNA，hsa-miR-26a-1-3p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-144-5p的低表达与肾透明细胞癌（KIRC）患者的不良预后显著相关。UALCAN数据库分析独立验证了miR-26a-1在肾癌组织中显著下调，而hsa-miR-144显著上调。
4. 基因表达模式与分期图分析
在523例KIRC组织与100例正常肾组织的比较中，CDK1和RUNX2的mRNA在肿瘤组织中显著上调，而CRP的mRNA水平未见显著升高。分期图分析进一步显示，CDK1和RUNX2的表达在不同肿瘤分期（I-IV期）间存在显著差异，提示它们可能与疾病进展相关；而CRP的表达在各分期间无显著差异。
5. RT-PCR验证
对5例肾癌组织和5例正常肾组织的RT-PCR分析证实，RUNX2在肾癌组织中的表达水平显著高于正常组织。
6. RUNX2和CDK1表达与预后意义的独立验证
在独立的GEO数据集GSE76351中，RUNX2（FC=1.89）和CDK1（FC=1.88）在RCCC组织中均显著过表达。基于TCGA–KIRC队列RNA-Seq数据的生存分析进一步证实，RUNX2（HR=1.93）和CDK1（HR=2.26）的高表达与患者总生存期缩短显著相关。
7. miRNA-靶基因表达相关性分析
在TCGA–KIRC队列中，hsa-miR-26a-1-3p与RUNX2表达呈微弱但显著的负相关（r = -0.153）。hsa-miR-144-3p与RUNX2和CDK1也显示出微弱的负相关。这些结果表明了潜在的miRNA-mRNA调控关系，但效应值较小，提示调控可能是多因素和情境依赖的。
讨论
本研究鉴定的三个miRNA（miR-26a-1-3p， miR-144-3p， miR-144-5p）和三个枢纽基因（CRP， CDK1， RUNX2）在RCCC的预后中具有重要价值。已有研究支持这些发现：例如，miR-26a-1-3p在转移性RCC中显示出预后价值；miR-144-3p可通过与长链非编码RNA NORAD相互作用影响MYCN表达；血清和肿瘤内CRP水平与RCCC不良预后相关；CDK1作为细胞周期关键激酶，其活性与RCCC增殖和迁移密切相关；RUNX2则通过与SCD1、Zic2、MAPK11等分子相互作用，促进RCCC的恶性进展。此外，本研究富集出的PI3K–Akt通路在RCCC中被广泛报道，靶向该通路可能具有治疗潜力。当然，本研究也存在一些局限性，如初始分析样本量较小、部分标志物未进行实验验证、鉴定的miRNA-mRNA相关性需要进一步的功能实验确认等。
结论
本研究通过整合生物信息学分析和多层面验证，系统揭示了RCCC中15个DEMs和75个枢纽基因的失调。特别指出，miR-26a-1-3p、miR-144-3p和miR-144-5p的低表达，以及CDK1和RUNX2的高表达，是RCCC强有力的预后标志物。这些分子通过影响PI3K–Akt、MAPK等关键信号通路，参与调控细胞凋亡和细胞周期进程，共同驱动RCCC的发生发展。这些发现为深入理解RCCC的分子机制、开发新的预后评估工具以及探索个性化治疗策略提供了重要的理论依据和潜在的干预靶点。
