Rho GTP酶RhoD与Rho GEF Bud3相互作用，参与黄曲霉（Aspergillus flavus）中的黄曲霉素生物合成、细胞壁完整性以及致病性过程

《Microbiological Research》：Rho GTPase RhoD interacts with the Rho GEF Bud3 and is involved in aflatoxin biosynthesis, cell wall integrity, and pathogenicity in Aspergillus flavus

黄曲霉RhoD及其GEF Bud3通过调控细胞壁完整性、有机酸分泌和ROS稳态影响致病性及毒素合成，基因敲除突变体表型与echinocandin处理相似，揭示了G蛋白信号转导在真菌致病机制中的作用。

　　

Jia Xu|Yanyan Zhang|Junhe Ren|Mingwei Liu|Yantong Huo|Qing Kong

中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛266404

摘要

黄曲霉是一种机会性病原体，具有广泛的宿主范围，能产生高致癌性的黄曲霉素，对食品安全、农业和公共健康构成重大威胁。在本研究中，我们发现了信号转导途径中的关键分子开关RhoD及其鸟嘌呤核苷酸交换因子Bud3。失去rhoD或bud3会导致分生孢子形成缺陷、无法产生菌核、黄曲霉素生物合成受阻以及花生和玉米的致病性降低。通过指示实验结合多组学分析证实，rhoD基因的缺失导致黄曲霉素生物合成相关基因的表达下调和前体代谢物含量减少。此外，RhoD还参与黄曲霉中的有机酸分泌、活性氧平衡、脂质代谢和细胞壁完整性。在ΔrhoD突变体中，隔膜和外部纤维层的完全缺失削弱了黄曲霉对外部刺激的响应能力，并增加了细胞壁上病原体相关分子模式的暴露。值得注意的是，ΔrhoD突变体表现出的表型与使用棘孢菌素卡波芬菌素处理后的结果相似，包括β-1,3-葡聚糖含量降低以及几丁质和甘露聚糖水平的代偿性增加。这些发现表明RhoD在黄曲霉的生长、黄曲霉素生物合成和致病性中起着重要作用，并为开发更有效的控制策略以减少黄曲霉污染提供了见解。

引言

黄曲霉是一种全球分布的腐生真菌（Amaike和Keller，2011年）。作为机会性病原体，它可以感染多种作物和副产品，包括棉花、花生、坚果、玉米、水稻、辣椒和无花果（Mellon等人，2007年；Yu等人，2024a年）。在感染过程中，黄曲霉采用多种策略来破坏宿主组织。分生孢子和菌核是黄曲霉的主要繁殖结构（Chang等人，2018年）。分生孢子作为接种源大量传播并附着在植物表面以引发感染（Amaike和Keller，2009年）。菌核可以在恶劣环境中存活并在后续季节萌发产生分生孢子（Yang等人，2024年）。黄曲霉分泌多种胞外水解酶，这些酶可以中和植物的防御分子并降解多糖屏障，从而促进组织破坏（Han等人，2020年）。在感染部位，黄曲霉分泌柠檬酸和草酸等有机酸，这些酸可以酸化周围环境并增强降解酶的活性（Kumar等人，2024年）。在植物-病原体相互作用过程中，黄曲霉采用多种策略来抵御不利的环境条件。真菌细胞壁是病原体与宿主之间的第一道防线（Ruf等人，2025年）。黄曲霉的细胞壁由双层结构组成，内层由几丁质和β-1,3-葡聚糖构成，提供强度并维持细胞壁的物理形状（Ebrahimi等人，2023年）。外层细胞壁的组成因菌株类型、菌丝和分生孢子而异。由紧密排列的纤维结构组成的棒状层赋予了独特的保护特性，并在感染期间介导与环境和宿主的相互作用（Van De Veerdonk等人，2017年；Garcia-Rubio等人，2019年）。此外，外层中的α-1,3-葡聚糖能够抵抗植物的降解，作为一种“隐身”策略，使真菌病原体能够逃避由病原体相关分子模式（PAMPs）引发的免疫识别（Chang等人，2018年）。活性氧（ROS）是早期真菌-宿主相互作用的关键介质，会触发植物对病原体的过敏反应。为了应对这一点，黄曲霉通过其抗氧化系统解毒多余的ROS以防止细胞损伤（Mittler，2017年；James等人，2024年）。成功定植后，黄曲霉会产生多种霉菌毒素，其中最著名的是黄曲霉素（Duran等人，2007年）。黄曲霉素是最具毒性和致癌性的天然化合物之一（Amaike和Keller，2011年），被国际癌症研究机构列为1类致癌物（Eaton和Gallagher，1994年）。总之，黄曲霉利用多种策略感染宿主植物、适应不利的环境条件并产生有毒的次级代谢物。这些多样的机制突显了其致病性的复杂性，强调了采取有效措施减少其对农业和食品安全的负面影响的紧迫性。

黄曲霉拥有许多保守的致病基因，这些基因编码效应分子（Zhu等人，2020年）、转录因子（Yu等人，2024b年）以及参与信号转导途径的关键组分（Zhu等人，2021年）。小的单体Rho型GTP酶作为真核生物信号转导途径中的分子开关，其特征是具有GTP和GDP结合结构域、质膜定位结构域以及GTP酶活性结构域（Rasmussen和Glass，2005年）。Rho GTP酶在活性GTP结合态和非活性GDP结合态之间循环，受鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）、GTP酶激活蛋白（GAPs）和鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（GDIs）的调控。在这些调节因子中，GEFs在将Rho GTP酶从非活性GDP结合态转化为活性GTP结合态的过程中起着关键作用（Schmidt和Hall，2002年）。在丝状真菌中，Rho GTP酶包括RacA、Cdc42和Rho蛋白。RhoD属于Rho家族，其在黑曲霉（Kwon等人，2011年）、拟青霉（Si等人，2010年）、禾谷镰刀菌（Oliveira-Garcia等人，2022年）和粗糙脉孢菌（Rasmussen和Glass，2007年）中具有影响隔膜形成的同源物。在禾谷镰刀菌中，RhoD对致病性和β-1,3-葡聚糖合成至关重要（Oliveira-Garcia等人，2022年）。ΔrhoD突变体表现出穿透缺陷、变形的营养菌丝和无性孢子形成障碍（Si等人，2010年）。在禾谷镰刀菌中，RhoD和与其相互作用的GEF蛋白Bud3对营养生长、无性和有性发育以及致病性都至关重要（Zhang等人，2018年）。在球孢白僵菌中，失去rhoD会导致生长速率降低、孢子产量减少、毒力减弱以及细胞内氧化还原平衡失调（Zou等人，2024年）。然而，关于黄曲霉中RhoD的了解仍然有限。

本研究鉴定了黄曲霉中的RhoD同源物及其GEF Bud3，这些因子对形态发生、黄曲霉素生物合成和致病性至关重要。通过指示实验结合多组学分析发现，rhoD基因的缺失导致黄曲霉素生物合成相关基因的表达下调和前体代谢物含量减少。RhoD还参与黄曲霉中的有机酸分泌、活性氧平衡和细胞壁完整性。在ΔrhoD突变体中，细胞壁成分的结构变化类似于使用棘孢菌素卡波芬菌素处理后的变化。此外，突变体的外层纤维层缺失，暴露了底层的β-葡聚糖和几丁质层，从而增强了宿主免疫系统的识别能力。这些发现表明RhoD在黄曲霉的生长、黄曲霉素生物合成和致病性中起着重要作用，并为开发更有效的控制策略以减少黄曲霉污染提供了见解。

部分摘录

菌株和培养条件

本研究使用的所有黄曲霉菌株列于表S1中。黄曲霉 NRRL3357被用作野生型菌株。黄曲霉 TJES19.1（Δku70，ΔpyrG）被用作转化的亲本菌株，并在添加尿嘧啶（2 mg/mL）的V8果汁固体培养基上培养。所有菌株均在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）、葡萄糖最小培养基（GMM）和酵母提取物蔗糖（YES）培养基上于30°C下培养，以进行表型分析。

基因缺失和互补菌株的构建

基因缺失和互补突变体

RhoD的序列和相互作用位点分析

黄曲霉中的rhoD基因包含970个核苷酸，包括三个外显子和两个内含子，编码一个282个氨基酸的蛋白质。RhoD蛋白包含五个保守的小GTP酶结构域（G1-G5框）和一个膜定位序列（图S2）。在代表性真菌中，黄曲霉的RhoD蛋白与稻曲霉的RhoD蛋白最为相似（图1A）。黄曲霉中的bud3基因包含4,620个核苷酸，编码一个1,539个氨基酸的蛋白质（图S3A）。

讨论

Rho蛋白家族因其在整合细胞内信号转导途径与外部环境变化中的作用而受到广泛关注（Bar-Sagi和Hall，2000年）。本研究利用Y2H系统鉴定了RhoD及其GEF Bud3。Bud3促进GDP与GTP的交换，从而激活RhoD（Zhu等人，2021年）。因此，我们认为Bud3通过调节RhoD的活性间接调控黄曲霉。在禾谷镰刀菌中，rhoD和bud3具有类似的功能

CRediT作者贡献声明

Mingwei Liu：验证、监督、软件使用、资源提供。Yantong Huo：写作——审稿与编辑、可视化、验证。Jia Xu：写作——初稿撰写、研究调查、数据管理、概念构思。Yanyan Zhang：软件使用、方法论设计、正式分析。Junhe Ren：监督、软件使用、资源提供、正式分析、数据管理。Qing Kong：项目管理、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（32072328）对这项研究的支持。