通过ComQXPA群体感应系统调控枯草芽孢杆菌抗单核细胞增生李斯特菌活性的机制研究

《Microbiological Research》：Modulation of Bacillus subtilis anti- Listeria activity via the ComQXPA quorum sensing system

本文针对单核细胞增生李斯特菌在食品环境中形成的顽固生物膜带来的严重健康风险，研究了益生菌株枯草芽孢杆菌PS-216的抗李斯特菌活性及其调控机制。研究发现，该菌株能通过其ComQXPA群体感应系统，协调表面活性素和杆菌溶素的产生，从而发挥强大的抗菌和抗生物膜作用。这项工作揭示了益生菌与食源性病原体相互作用的新机制，为开发基于芽孢杆菌的食品生物保鲜策略提供了重要的理论基础和菌株资源。

　　

单核细胞增生李斯特菌是一种革兰氏阳性的人畜共患病原体，它能引发李斯特菌病。这种疾病在欧盟是第五大常见的食源性疾病，其住院率和死亡率却高居榜首。更棘手的是，这种病原体在食品加工环境中能形成顽固的生物膜，生存数月之久，构成了持续的污染风险。控制李斯特菌的传统方法面临挑战，因此，探索利用环境中的有益微生物——例如益生菌——来抑制其生长和生物膜形成，成为一种有前景的生物防治策略。在众多候选者中，枯草芽孢杆菌因其能够产生多种抗菌物质并形成耐热孢子而备受关注。然而，其抗李斯特菌活性的具体分子机制，尤其是关键的群体感应（Quorum Sensing， QS）系统在其中扮演的角色，尚不明确。

为解决这些问题，来自卢布尔雅那大学的研究团队在《Microbiological Research》上发表了他们的研究成果。他们选取了一株已知能产生表面活性素、且对革兰氏阴性病原体有活性的枯草芽孢杆菌PS-216，深入探究了它对两种李斯特菌（致病性的单核细胞增生李斯特菌及其非致病性替代菌株英诺克李斯特菌）的拮抗作用。研究的核心目标是阐明ComQXPA群体感应系统在调控这一抗李斯特菌活性中的中心作用。

研究人员首先利用共培养实验评估了野生型枯草芽孢杆菌PS-216及其一系列基因敲除突变体（包括缺失群体感应关键基因的ΔcomQ、ΔcomA，以及缺失ComA调控的抗菌物质合成基因的ΔsrfAA（表面活性素）、ΔbacA（杆菌溶素）和双突变体ΔsrfAAΔbacA）的抗李斯特菌效果。接着，他们通过构建带有黄色荧光蛋白（YFP）报告基因的菌株（P_comQ-yfp， P_srfAA-yfp， P_bacA-yfp），在群体水平和单细胞水平上监测了共培养条件下这些基因的表达动态。最后，他们通过细胞无上清液（Cell-Free Supernatant， CFS）处理实验，评估了枯草芽孢杆菌胞外化合物对李斯特菌生物膜形成的影响，并结合激光共聚焦显微镜（CLSM）观察了生物膜形态的变化。

主要技术方法概述

研究采用了静态共培养系统评估抗菌活性；利用YFP荧光报告系统（包括P_comQ-yfp， P_srfAA-yfp， P_bacA-yfp）通过酶标仪和流式细胞术在群体及单细胞水平分析基因表达；通过细胞无上清液（CFS）处理结合平板计数法检测抗粘附活性；使用激光共聚焦显微镜（CLSM）观察和表征李斯特菌生物膜的形态结构。

研究结果

3.1. 枯草芽孢杆菌PS-216在共培养中的抗李斯特菌效应受ComQXPA QS系统调控并通过表面活性素和杆菌溶素发挥作用

共培养实验显示，枯草芽孢杆菌PS-216野生型菌株对单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌均表现出强烈的拮抗活性，分别使其菌落形成单位降低了5.9 log和6.7 log。所有测试的突变体菌株的抗李斯特菌活性均显著弱于野生型。其中，ΔcomA突变体和双突变体ΔsrfAAΔbacA的抑制效果最弱。这表明ComQXPA QS系统及其调控的抗菌物质表面活性素和杆菌溶素对于枯草芽孢杆菌PS-216发挥最强的抗李斯特菌活性至关重要，且两种物质协同作用。

3.2. 基因表达

单细胞水平的基因表达分析提供了更深入的见解。在共培养条件下，表达comQ的细胞比例与单培养相似，但每个细胞的荧光强度在培养4小时后显著增强。srfAA的表达则呈现动态变化：在共培养4小时后，表达该基因的细胞比例增加了4.4倍，但每个细胞的表达强度却降低了；到24小时后，表达细胞比例反而大幅下降。相比之下，bacA的表达在共培养中被持续上调，无论是在表达细胞比例还是单个细胞的表达强度上，在4小时和24小时两个时间点均显著高于单培养条件。这些结果说明，枯草芽孢杆菌能感知李斯特菌的存在，并动态调整其抗菌相关基因的表达，其中bacA的诱导表达尤为显著。

3.3. 枯草芽孢杆菌PS-216无细胞上清液的抗李斯特菌生物膜效应受ComQXPA QS系统控制且很大程度上依赖于表面活性素的产生

研究人员测试了枯草芽孢杆菌野生型及其突变体的无细胞上清液对英诺克李斯特菌粘附和生物膜形成的影响。结果显示，野生型菌株的上清液能显著抑制李斯特菌在聚苯乙烯表面的粘附。这种抗粘附活性在ΔcomQ和ΔcomA突变体的上清液中显著减弱。激光共聚焦显微镜观察发现，在营养丰富的培养基中，李斯特菌会形成覆盖整个表面的草坪型生物膜。而野生型枯草芽孢杆菌的上清液能严重破坏这种生物膜结构，使其变为孤立的聚集体。表面活性素缺陷型突变体ΔsrfAA的上清液处理则允许李斯特菌形成聚集体和薄层草坪型生物膜，表明表面活性素在破坏李斯特菌生物膜形成中起着关键作用。

结论与意义

这项研究首次揭示了杆菌溶素以及枯草芽孢杆菌ComQXPA群体感应系统在控制李斯特菌生长和生物膜发育中的关键作用。研究证实，枯草芽孢杆菌PS-216通过其ComQXPA系统协调表面活性素和杆菌溶素的产生，从而对单核细胞增生李斯特菌及其替代模型英诺克李斯特菌发挥强大的抗菌和抗生物膜活性。同时，研究发现李斯特菌的存在能够动态调节枯草芽孢杆菌中srfAA和bacA启动子的活性，揭示了病原菌与有益菌之间复杂的双向相互作用。

这项工作的意义重大。首先，它提出并验证了枯草芽孢杆菌PS-216作为一种高效的李斯特菌拮抗菌株，展现了其作为食品生物保鲜剂或环境益生菌剂的巨大潜力。其次，研究从分子机制层面阐明了ComQXPA群体感应系统的核心调控作用，以及表面活性素和杆菌溶素的协同功能，为理性设计和优化基于芽孢杆菌的生物防治策略提供了理论依据。最后，研究证实英诺克李斯特菌在研究李斯特菌-芽孢杆菌相互作用机制方面是一个有效的替代模型，这为在非生物安全二级（BSL2）条件下开展相关研究提供了便利。这些发现不仅增进了我们对微生物种间竞争的理解，也为开发控制食品加工环境中顽固病原体的新方法开辟了道路。