利用抗病毒肽修饰的银纳米粒子进行寨卡病毒滴度检测的单体电化学方法

《Microchemical Journal》：Single-entity electrochemistry for Zika Virus titer detection with antiviral peptides modified silver nanoparticles

开发基于单实体电化学和机器学习的纳米传感器平台，通过抗病毒肽修饰银纳米颗粒实现寨卡病毒的高灵敏检测（LOD≈6 titers），验证其在蚊提取物中的稳定性（R2>0.99），为快速便携诊断提供新方法。

　　

Zihni Onur Uygun

卡夫卡斯大学医学院医学生物化学系，土耳其卡尔斯

摘要

蚊子传播的病毒继续对全球健康构成重大威胁，尤其是在诊断基础设施有限的地区。本文报道了一种电化学纳米传感器平台，通过整合单分子电化学（SEE）和机器学习辅助的事件分析技术，实现快速、灵敏的寨卡病毒（ZIKV）检测。将具有针对ZIKV包膜蛋白亲和力的抗病毒肽（AVPs）与银纳米颗粒（AgNPs）结合，形成生物识别纳米探针。通过ζ电位、动态光散射（DLS）和扫描电子显微镜（SEM）对AVP–AgNP缀合物进行了表征，证实了其胶体稳定性和表面修饰效果。使用碳纤维微电极进行SEE测量时，裸露的AgNPs、AVP修饰的AgNPs以及病毒结合的AgNPs产生了不同的电流-时间曲线，从而能够可视化结合相关的碰撞特征。校准结果显示，在10–600滴度范围内具有线性响应（R2 = 0.988），检测限（LOD）约为6滴度，定量限（LOQ）约为14滴度。机器学习有助于自动化事件分类和噪声处理，提高了分析通量和信号的可解释性。在蚊子提取物基质（喂食和未喂食）中进一步评估了性能，在测试条件下基质效应有限，响应仍保持线性（R2 > 0.99）。这些发现支持SEE-机器学习作为ZIKV筛查的概念验证方法，并为未来的多重蚊子传播病毒检测提供了框架。

引言

蚊子相关病毒（MAVs）是全球公共卫生的主要问题，预计在未来几十年内将成为最严重的病毒流行威胁之一[1]。随着全球化的加剧，蚊子的地理分布及其传播的病毒也变得更加广泛[2]。在这些病毒中，寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗河病毒（WNV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、登革热病毒（DENV）、黄热病病毒（YFV）和裂谷热病毒（RVFV）由于其广泛的流行性和严重的健康影响而尤为令人担忧[3],[4],[5]。这些蚊子传播病原体导致的显著发病率和死亡率突显了对其检测、监测和控制的迫切需求。西非是一个复杂的媒介-病毒生态系统，其中Aedes、Culex和Anopheles等多种蚊子种类在病毒传播中起着关键作用，对当地和全球健康都有重要影响[6],[7],[8]。特别是Aedes aegypti和Aedes albopictus已被确定为DENV、ZIKV、CHIKV和YFV等病毒的主要媒介，这强调了针对这些蚊种进行检测和控制的重要性[9]。

每种病毒都表现出不同的生物学和流行病学特征，需要特定的诊断方法。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）仍然是这些病毒早期和特异性检测的金标准[10],[11]。虽然血清学检测对于流行病学监测和晚期诊断很有价值，但由于黄病毒家族内病毒之间的交叉反应性，可能会变得复杂[12]。因此，准确诊断通常需要结合临床评估、流行病学背景和确认性实验室检测，以确保可靠地识别致病因子。在这种情况下，开发快速且低成本的诊断技术至关重要。其中最有前景的方法是生物传感器系统，它们在产品转化方面具有巨大潜力，能有效解决这一领域的关键需求。电化学传感器技术作为一种创新工具，在病毒诊断中得到了广泛应用[13],[14]。与传统诊断方法相比，这些系统具有高灵敏度、低成本、便携性和快速响应时间等优点。电化学生物传感器的基本原理是通过可测量的电化学信号变化来检测病毒或病毒特异性生物分子（如抗原或核酸），从而实现精确高效的病毒感染识别。在生物传感器系统中，实现灵敏和选择性检测的关键在于生物识别元件的性质[15]。固定化在这方面起着至关重要的作用，因为将生物识别剂固定在传感器表面的方法和效率直接影响重复性和灵敏度[15]。因此，先进的传感器系统必须集成能够进行高灵敏度生物测量的下一代分析方法，同时不失去其活性。

目前，能够分析单个分子的技术为克服当前限制提供了重要机会。其中一种有前景的方法是单分子电化学（SEE），也称为碰撞电化学、随机碰撞电化学或纳米碰撞电化学[16],[17]。该方法能够实现单个纳米颗粒、生物分子或病毒颗粒的电化学检测和表征，如本研究所示，具有出色的灵敏度，并能够以前所未有的精度研究纳米尺度上的相互作用[18],[19]。这是一种超灵敏的分析技术，近年来在分析化学和生物传感器技术方面取得了显著进展[20],[21],[22]。该方法使得研究单个分子或纳米材料的电化学行为成为可能，为分析和理解分子级过程提供了强大手段。测量单个分子需要在空间或时间上隔离单个颗粒的响应，同时保持足够的信噪比以检测微弱信号[23]。与传统宏观电化学技术不同，单分子测量本质上是随机的，即单个事件的发生受概率而非确定性行为控制[24],[25]。当微电极浸入纳米颗粒悬浮液中时，布朗运动会导致纳米颗粒与电极之间的离散电化学响应。这些相互作用可能导致电化学反应的阻断、颗粒的氧化或还原，或电化学过程的催化增强。因此，SEE不仅提供了关于颗粒电化学和反应动力学的宝贵信息，还提供了关于单个颗粒运动、大小和动态的信息。与传统电化学技术相比，SEE代表了更灵敏和实用的分析方法，能够进行纳米尺度表征和实时监测单个电活性事件。此外，由于没有固定生物识别元件，通过制备针对特定生物分子的纳米缀合物可以提高特异性。在本研究中，使用的生物识别分子是抗病毒肽（AVP），它具有抗变性且成本低廉。AVP作为一种阳离子、两亲性α-螺旋肽，作为宿主防御分子是理想的候选者。

AVPs的主要作用机制被认为是膜通透性[26]。阳离子AVPs可以与带负电荷的细菌细胞膜结合并相互作用，导致电化学势的变化、膜破坏以及细胞内物质（如蛋白质和其他大分子）的泄漏。这一过程最终导致细胞死亡。由于其广泛的抗菌谱，包括抗菌、抗真菌、抗病毒和抗癌活性，AVPs相比传统抗生素具有明显优势，并已被证明可以克服细菌耐药性[27]。

关于这些肽及其对各种病原体的活性的信息可以在抗菌活性和肽结构数据库（DBAASP）（https://dbaasp.org/）中找到，该数据库为设计具有高治疗指数的抗病毒化合物的研究人员提供了宝贵资源（寨卡AVP：AWDFGSVGGVFNSLGKGIHQIFGAAFKSL）。通过利用DBAASP等数据库中的AVP-靶标生物分子匹配，可以实现基于肽的病毒识别系统的合理设计，使AVPs成为基于SEE的病毒纳米传感器的强大生物识别组分。本研究的核心概念是利用SEE测量具有不同氧化电位的银纳米颗粒（AgNPs）。对于每种目标病毒，从数据库中选择特定于该病毒的肽序列，并将其与银纳米颗粒结合。然后通过这些肽-AgNP缀合物与微电极表面的碰撞来分析它们，从而实现尺寸表征和单分子水平的电化学分析。在数据处理阶段，使用机器学习算法分析从SEE测量中获得的高分辨率数据集。这些算法用于促进高效的数据分类、噪声减少和模式识别，从而准确区分病毒目标。SEE与机器学习的结合为多种蚊子传播病毒的特异性、灵敏性和快速检测提供了强大的自动化分析平台[29]。虽然分子检测仍然是虫媒病毒诊断的参考方法，但最近的研究强调了便携式和分散式替代方案的需求。例如，一种多重实时RT-PCR可用于联合检测RVFV/CHIKV/ZIKV/DENV，报告了分析物的特异性检测限（包括ZIKV的LOD，单位为拷贝/mL），并强调了在低病毒载量下的性能权衡，说明了分子工作流程的优点和物流限制[30]。同时，越来越多的文献展示了针对寨卡及相关虫媒病毒的非PCR诊断方法，包括使用金纳米颗粒辅助的DLS检测ZIKV NS1蛋白，显示出对DENV2 NS1和其他蛋白质的选择性[31]，以及基于SERS的平台，如银纳米岛基底，能够在ng/mL范围内检测寨卡病毒[32]。电化学生物传感也被广泛用于虫媒病毒目标（例如ZIKV包膜/NS蛋白），受益于可微型化的读出和快速分析[33]。重要的是，面向现场的工作流程已经超越了实验室演示；例如，针对血清样本中寨卡和基孔肯雅病毒的双盲现场验证报告了与培养样本中的RT-qPCR相当的高诊断准确性和灵敏度及分析性能，支持了分散式虫媒病毒检测的可行性[34]。在此背景下，本研究作为概念验证，证明了单分子电化学（SEE）结合机器学习辅助的事件分类可以生成寨卡相关结合事件的区分性碰撞特征。由于测量对象和单位（RNA拷贝/mL、蛋白质浓度、PFU或供应商定义的“滴度”）的不同，跨平台的直接数值比较应谨慎解释，但引用的研究提供了相关的性能范围，并阐明了非PCR方法的优势/局限性。

材料

所有化学品均从Merck（美国）获得。蚊子样本随机收集作为混合样本滤液。寨卡病毒（热灭活型VR-1843HK）从ATCC（英国）获得。在本手稿中，“滴度”指的是从ATCC VR-1843HK储备材料制备的系列稀释水平（具体信息见分析证书），而不是基于感染力的PFU/mL值。使用的电化学分析仪为Ivium CompactStat2.h10800 with Internal Booster

方法

碳纤维电极是在毛细管玻璃中制备的单个碳纤维电极（SCF）[35]。简而言之，在显微镜下使用微镊子折断玻璃毛细管的尖端，暴露出大约10毫米的碳纤维。将环氧树脂涂抹在断裂区域，然后从另一端轻轻拉入碳纤维以密封并固定到位。在另一端，通过在一端涂覆Ag/AgCl浆料来制备铜线，然后插入

结果

使用Zetasizer进行ζ电位测量，以监测每个功能化步骤的表面电荷变化（补充图1A）。裸露的AgNPs表现出负ζ电位-28 ± 6 mV，这与生理pH下由静电排斥稳定的胶体一致[40]。MPA修饰后，ζ电位变得更负（-41.5 ± 3.5 mV），这与纳米颗粒表面引入羧基末端配体相符。

结论

本研究旨在证明单分子电化学结合机器学习辅助分析可以区分寨卡相关信号。因此，完整的技术经济或每次测试的成本分析超出了当前手稿的范围。尽管如此，所提出的工作流程本质上符合低成本部署原则：它与基于紧凑型电位计的仪器兼容，依赖于

CRediT作者贡献声明

Zihni Onur Uygun：撰写——原始草稿、方法学、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了卡夫卡斯大学科学研究项目协调单位（项目编号：2024-TS-51）和科学学院（BAGEP-2025）的支持。