开发了一种简化版的单管RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法，用于快速且可视化地检测新出现的猪肠道α冠状病毒

《Microchemical Journal》：Development of a streamlined one-tube RT-RAA-CRISPR/Cas12a assay for the rapid and visual detection of the emerging porcine enteric alphacoronavirus

猪肠道α冠状病毒（PEAV）新型快速检测方法研发及验证。采用RT-RAA与CRISPR-Cas12a联用技术，靶向N基因保守区，30分钟内通过荧光或试纸条检测，灵敏度达16.82 copies/μL，特异性100%，临床样本检测符合率达97.1%-98.3%。创新设计 nested反应管实现两步封闭检测，降低交叉污染风险，适用于现场快速诊断。

　　

王文龙|张永宁

中国农业大学兽医学院兽医公共卫生与安全国家重点实验室，北京100193，中国

摘要

猪肠道α冠状病毒（PEAV）于2017年首次在中国广东省被发现，是一种新兴的肠道病原体，可导致猪严重腹泻，尤其是在哺乳仔猪中，造成巨大的经济损失。其潜在的人畜共患风险凸显了快速准确诊断方法的迫切需求。在此，我们开发了一种新型核酸检测方法，该方法结合了逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）和CRISPR-Cas12a系统，靶向PEAV核衣壳（N）基因中的一个高度保守区域。该检测方法通过实时荧光或侧向流动试纸条（LFD）在30分钟内提供结果。为了简化工作流程并减少气溶胶污染，我们共同开发了一种集成反应装置，在一个嵌套管中物理分离RT-RAA和Cas12a试剂。使用重组质粒标准品的评估表明，荧光读数的灵敏度非常高，检测限为16.82拷贝/μL（95%概率），优于LFD格式（388.92拷贝/μL）和参考实时RT-PCR检测方法（149.74拷贝/μL）。两种检测格式均表现出高特异性，未与其他常见猪病原体发生交叉反应。使用175个样本进行的临床验证显示，与参考方法的结果高度一致，荧光方法的符合率为97.1%，LFD方法的符合率为98.3%，Cohen's κ值分别为0.933和0.986。这种单管检测方法有效降低了交叉污染的风险，并简化了检测过程。由于仅需便携式蓝光照明器或LFD即可解读结果，因此特别适合资源有限的环境，是快速控制疫情和监测PEAV的关键工具。

引言

2017年，中国广东省的一个农场发生了大规模的腹泻疫情，新生仔猪在出生后五天内死亡率约为90% [1]。受影响的仔猪表现出严重腹泻、呕吐和脱水症状，哺乳母猪也出现了腹泻症状，导致重大经济损失 [1]，[2]。致病因子被鉴定为一种新的猪肠道冠状病毒，从腹泻仔猪的肠道样本中分离出来，随后被命名为猪肠道α冠状病毒（PEAV）。PEAV也被称为猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）或猪肠道α冠状病毒（SeACoV） [1]，[2]。PEAV是一种有包膜的单链正链RNA病毒，基因组长度约为27,000个碱基对。在分类学上，它属于冠状病毒科（Coronaviridae）中的α冠状病毒属（Alphacoronavirus）[3]。其基因组由5′和3′非翻译区（UTRs）包围，这些区域编码ORF1a/ORF1b多聚蛋白、四种结构蛋白（刺突蛋白[S]、包膜蛋白[E]、膜蛋白[M]和核衣壳蛋白[N]，以及三种辅助蛋白（NS3a、NS7a、NS7b）[1]，[4]。

基于全基因组测序的系统发育分析显示，PEAV与2004年至2006年间在广东和香港发现的四种蝙蝠肠道α冠状病毒（HKU2-CoV）株具有约95%的核苷酸同源性，强烈表明其起源于蝙蝠 [1]，[5]，[6]。由于蝙蝠已被确定为人畜共患冠状病毒（如严重急性呼吸综合征冠状病毒[SARS-CoV]（通过果蝠）和中东呼吸综合征冠状病毒[MERS-CoV]（通过骆驼）的宿主，PEAV的跨物种传播潜力引起了重大关注 [7]。体外研究表明，PEAV具有广泛的物种嗜性，在猪、家禽、非人灵长类动物以及啮齿类动物（大鼠、小鼠、沙鼠和仓鼠）的细胞系中能够高效复制 [8]。实验感染证实，C57BL/6J小鼠通过口服和腹腔注射途径均易感 [8]。值得注意的是，PEAV还能感染多种人类细胞系（Huh-7.5、CaCo2、ST-INT、HRT、HepG2/C3A、293T、A549、HeLa）[8]，[9]以及原代人类肺/肠道细胞（如微血管内皮细胞、气道上皮细胞），这突显了其人畜共患风险 [9]，[10]。临床上，PEAV引起的猪腹泻与其他主要肠道冠状病毒（如猪流行性腹泻病毒[PEDV]和猪δ冠状病毒[PDCoV]引起的腹泻无法区分，这凸显了开发特定诊断工具的迫切需求，以便及时控制疫情并防止进一步传播。

目前的PEAV诊断方法分为基于核酸的检测方法和免疫检测方法。基于核酸的方法根据反应原理进一步分为依赖热循环的扩增技术和等温扩增技术。依赖热循环的方法，如基于TaqMan的实时RT-PCR [11]，[12]和滴液数字PCR（ddPCR）[13]，因其高灵敏度和定量准确性而受到重视。然而，这些方法需要复杂的热循环仪、较长的周转时间（≥60分钟）和熟练的操作人员，限制了其在资源有限的环境（如养猪场或当地兽医站）中的应用。相比之下，基于等温扩增的核酸检测方法，包括重组酶聚合酶扩增（RPA）荧光检测 [14]、实时逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）[15]和微流控RT-LAMP芯片 [16]，专为现场使用设计。这些方法在恒定温度（37–65°C）下运行，无需热循环设备，可在30–40分钟内完成扩增。然而，它们也存在一些缺点：RPA在常温条件下的试剂稳定性有限，温度耐受性窄；而RT-LAMP及其微流控衍生物由于多引物设计容易发生非特异性扩增 [16]。相比之下，免疫检测方法（如间接ELISA [17]）操作简单且成本低，但灵敏度较低，不适合病毒载量较低的早期诊断。鉴于现有诊断方法的这些局限性，迫切需要开发一种兼具高灵敏度、强特异性、操作简便性和现场适应性的PEAV检测工具，以满足快速现场诊断的需求。

在上述等温扩增技术中，RPA是一种经典原型，它利用重组酶（一种单链DNA结合蛋白）和链置换DNA聚合酶来扩增核酸 [14]，[18]。重组酶辅助扩增（RAA）是一种优化的商业变体，保留了RPA的核心机制，同时解决了其关键限制——即温度耐受性窄和试剂稳定性差的问题。RAA具有更宽的操作温度范围（通常为37–45°C）、更快的扩增动力学（≤30分钟）和在常温条件下的更好试剂稳定性 [19]，[20]，[21]，[22]，使其特别适合资源有限的现场环境。基于这些优势，我们选择RAA作为PEAV诊断检测的扩增模块。此外，CRISPR/Cas系统由CRISPR序列和相关Cas蛋白组成，最初在细菌和古菌中作为适应性免疫机制，用于防御外来遗传物质 [23]，[24]。该系统利用CRISPR RNA引导Cas内切酶（如Cas12a）特异性切割目标DNA [25]。重新用于核酸检测后，CRISPR/Cas12a表现出目标激活的转切割活性，能够非特异性切割单链DNA报告分子，从而实现荧光或侧向流动读数 [25]，[26]，[27]。然而，单独使用CRISPR/Cas12a检测通常灵敏度有限且反应动力学较慢。通过将其与等温扩增技术（如RAA）结合，可以克服这一限制，创造出针对SARS-CoV-2、非洲猪瘟病毒、PEDV和Cladobotryum mycophilum等病原体的高灵敏度检测平台 [28]，[29]，[30]，[31]，[32]。将RAA与CRISPR/Cas12a结合的一个关键挑战是模板DNA和RAA扩增产物可能会过早激活Cas12a的顺式切割活性，导致引物降解和扩增效率降低 [33]，[34]。目前解决这一问题的策略通常需要将扩增和检测步骤物理分离，这增加了操作复杂性，延长了检测时间，并增加了气溶胶污染的风险，这些都是临床应用的重大障碍。

在这项研究中，我们分析了所有公开可用的PEAV菌株的完整基因组，并确定了N基因中的一个高度保守的约231 bp区域作为最佳诊断靶标。利用这一靶标，我们开发了一种双读数RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法，结果可通过便携式蓝光设备或侧向流动试纸条（LFD）解读。为了减少气溶胶污染并简化工作流程，我们设计了一种创新反应装置，其中RAA扩增在外层1.5 mL管中进行，而Cas12a检测试剂预先装载在内层管中。扩增后轻轻涡旋即可释放内层试剂，实现封闭管一步检测。这种设计保持了简单性和低污染风险，同时显著提高了效率和灵敏度，为现场PEAV核酸检测提供了可靠的解决方案。

部分片段

核酸提取、质粒构建和主要试剂

使用QIAamp Viral RNA Mini Kit或QIAamp DNA Micro Kit（Qiagen，德国希伦）根据制造商说明提取了我们实验室保存的以下菌株的病毒RNA或DNA：PEAV菌株GDZQ-2018（GenBank登录号MW727454.1）、伪狂犬病病毒（PRV）菌株HB1201（KU057086.1）、Senecavirus A（SVA）菌株SDta/2018（MN433300.1）、PDCoV菌株CHN-HN-1601（MG832584.1）、脑心肌炎病毒（EMCV）菌株BJC3（DQ464062.1）等。

RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的引物组合优化

生物信息学分析基于61个可用PEAV完整基因组序列的全面比对，确定N基因区域为PEAV检测的最佳靶标（图1和补充图S1）。根据TwistDx的设计建议，我们最初设计了五个正向（F1–F5）和五个反向（R1–R5）引物对进行初步筛选。使用ImageJ（美国马里兰州贝塞斯达的国家卫生研究院）定量评估了引物的性能。

讨论

PEAV对全球养猪业仍是一个持续威胁，最近在河南南阳等地发生的零星疫情导致超过400头仔猪死亡，这突显了快速、适应现场环境的诊断工具的必要性 [36]。其与其他猪肠道冠状病毒的临床表现重叠以及潜在的人畜共患风险进一步强调了开发特定、用户友好的检测平台的必要性，尤其是在资源有限的环境中。

结论

我们开发了一种RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法，针对PEAV N基因中最保守的区域，以实现PEAV核酸的快速可视化检测。该检测的结果可以通过便携式蓝光设备或LFDs解读。为了减少气溶胶污染和处理时间，我们设计了一种嵌套反应管，消除了RAA扩增产物和CRISPR/Cas12a试剂的开放管转移。这种集成系统提供了实用、高效和快速的解决方案。

CRediT作者贡献声明

王文龙：撰写——原始草稿、可视化、验证、软件、方法学、研究、数据分析、概念化。张永宁：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、数据分析、概念化。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国农业研究系统专项基金（CARS-35）和中国农业大学的P2115人才发展计划的支持。