利用深度共晶溶剂在超声辅助下高效提取山姜果（Alpiniae oxyphyllae fructus）中的多酚：UHPLC-HRMS/MS表征、抗氧化性能评估及DFT计算

《Microchemical Journal》：Ultrasound-assisted efficient extraction of polyphenols from Alpiniae oxyphyllae fructus using deep eutectic solvents: UHPLC-HRMS/MS characterization, antioxidant evaluation, and DFT calculations

超声辅助提取结合深共熔溶剂（DESs）可有效提高Alpiniae oxyphyllae果实中多酚的提取效率，其中Pro-LA体系提取的多酚含量达19.37 mg/g，显著高于水提和乙醇提。DFT计算表明DESs通过氢键作用增强多酚提取效果。本研究为植物多酚绿色高效提取提供了新方法。

　　

孙月|王俊涛|陈世雄|杨秦|刘新欣|李从发

海南大学食品科学与工程学院，海口，570228，中国，

摘要

本研究采用超声辅助深共晶溶剂（DESs）与传统溶剂对比提取了Alpiniae oxyphyllae果实中的多酚，并对其进行了全面的表征和比较。Choline chloride - malic acid (ChCl-MA) (1:1)、ChCl-MA (1:2)、L-proline-Lactic acid (Pro-LA) (1:1)、Pro-LA (1:3) 和 L-proline-citric acid (Pro-CA) (1:3) 提取物中的总多酚含量最高，范围为17.67至19.37 mg/g，显著高于水提取物（10.35 mg/g）和乙醇提取物（14.78 mg/g）（p < 0.05）。Pro-LA提取物中含有高水平的3,4-二羟基苯甲酸和原儿茶醛，并具有很强的抗氧化活性。密度泛函理论（DFT）计算表明，DESs高效提取多酚的机制主要体现在Pro-LA独特的结构上，这种结构有助于与多酚的羟基形成强氢键，从而增强分子间相互作用，提高提取效率。本研究为植物多酚的高效提取提供了一种新方法。

引言

Alpiniae oxyphyllae果实是一种重要的药用和食用植物，在中国海南、云南和广东等省份有悠久的历史[22] [30]。它不仅富含多糖、多酚、挥发油等营养成分，还具有多种生理功能。Alpiniae oxyphyllae果实常用于传统中医治疗肾脏疾病[35] [36]，如肾阳虚症（表现为腰痛、遗精、夜间遗尿等症状），以及肠道疾病[13] [18]，如脾胃虚寒（表现为消化不良、腹泻等症状）。最近的研究还表明Alpiniae oxyphyllae果实具有多种药理活性[27] [30] [36]，包括保护神经系统、调节免疫、抗氧化和抗炎作用。值得注意的是，Alpiniae oxyphyllae果实中的多酚通常被认为是其发挥功能活性的关键成分。从Alpiniae oxyphyllae果实中提取多酚对于开发健康功能性食品至关重要。

传统的多酚提取方法，如浸渍、渗滤以及使用酒精等有机溶剂，不仅消耗大量提取溶剂，提取效率较低，而且生物活性成分的含量也较低，同时对环境的友好性有限[3]。为了解决这些传统方法的缺点，开发高效且环保的提取方法对于研究和应用活性物质至关重要。深共晶溶剂（DESs）是一种新型环保溶剂，由氢键受体（HBA）和氢键供体（HBD）结合而成，可以替代传统溶剂。DESs具有高溶解度、低毒性和可生物降解性[5]，使其特别适合用于食品和制药领域的生物活性化合物提取。

许多研究已成功使用各种DESs（以ChCl作为HBA，结合尿素、甘油、乙二醇或有机酸（如柠檬酸、乳酸）等HBD）从水果、蔬菜和草药中提取多酚[29]。与传统溶剂相比，DESs能够高效提取生物活性化合物。这种效率的提升归因于两个主要因素：（1）通过选择和调整HBA和HBD的比例来调节DESs的性能[12]；（2）与超声辅助提取技术的协同作用[20] [31]。Juric等人指出，使用基于Choline chloride的DESs从Mentha piperita中提取的酚类化合物含量显著高于使用70%乙醇提取的含量[16]。此外，使用基于ChCl:MalA系统的DESs从酸樱桃渣中提取花青素的效率比使用EtOH和MeOH提高了62.33%[26]。虽然这些发现无疑证明了DESs在多酚提取中的高效性，但也凸显了关键挑战：首先，提取效率受DESs成分（包括HBA和HBD类型及其摩尔比）及其粘度的影响；其次，对于DESs高效提取多酚的基本机制仍缺乏全面理解；最后，使用DESs从Alpiniae oxyphyllae果实中提取多酚的研究还不够充分，限制了其进一步的发展和应用。

因此，本研究的目的是利用环保的DESs高效提取Alpiniae oxyphyllae果实中的多酚，并将其与传统的水和乙醇提取方法进行比较。首先制备了不同类型的DESs，系统研究了它们的物理化学性质，并验证了DESs的有效合成方法。随后，使用DESs和传统溶剂提取多酚，并通过UHPLC-Q-TOF-MS和UPCL-Q Exactive MS进行了多酚的定性和定量分析。此外，还通过体外实验评估了多酚的抗氧化活性，以验证DESs方法的有效性。最后，应用DFT计算阐明了DESs与多酚之间相互作用的分子机制。本研究为DESs介导的天然植物活性成分提取机制提供了新的见解。

材料与试剂

Alpiniae oxyphyllae果实由中国海南省陵水黎族自治县提供。Choline chloride（98%，ChCl）、betaine（98%）和L-proline（99%，Pro）购自上海Rawm公司。Lactic acid（≥98%，LA）、malic acid（99%，MA）和citric acid（≥99%，CA）购自上海Maikelin公司。所有标准品（如gallic acid、kaempferol、quercetin、rutin、epicatechin、trans-ferulic acid、3,4-二羟基苯甲酸、原儿茶醛等）均从相应公司购买。

深共晶溶剂的物理化学性质与筛选

DES的组成影响提取过程对植物活性成分的选择性和可调性，这对有效提取至关重要[21] [33]。为此，使用ChCl、betaine和Pro作为HBA，通过与不同类型的HBD（表S1）发生氢键相互作用，制备了36种不同的DESs。如图1A所示，DESs在室温下的稳定性归因于其独特的分子结构和相互作用力。

结论

本研究共制备了36种不同的DESs用于从Alpiniae oxyphyllae果实中提取多酚。初步筛选出五种粘度较低且多酚含量较高的DESs，分别为ChCl-MA (1:1)、ChCl-MA (1:2)、Pro-LA (1:1)、Pro-LA (1:3) 和 Pro-CA (1:3)。随后，在DESs提取物和传统溶剂提取物中鉴定出了23种多酚化合物，主要包括黄酮类、酚酸、苯及其衍生物等。

CRediT作者贡献声明

孙月：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。王俊涛：概念构思。陈世雄：数据管理。杨秦：实验研究。刘新欣：方法设计。李从发：项目监督与管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了中国海南省陵水黎族自治县人民政府的财政支持（HD-KYH-2023025）。