一种无标记的二维MnO?纳米酶基张力传感器，用于通过电压法检测细胞产生的粘附力

《Microchemical Journal》：A label-free 2D MnO 2 nanozyme-based tension-gauge tether biosensor for voltametric detection of cell-generated adhesion force through cell determination

DNA张力探针与MnO?纳米酶结合用于检测宫颈癌细胞产生的粘附力，通过双链DNA结构在12 pN和56 pN阈值下的断裂实现电化学信号增强，成功检测到500至5×10?数量级细胞粘附力，展现出高灵敏度与宽动态范围。

　　

Mohammad Ali Farzin | Seyed Morteza Naghib

伊朗德黑兰伊朗科技大学（IUST）先进技术学院纳米技术系

摘要

细胞产生的黏附力可以促进肿瘤生长和局部侵袭，并削弱对各种治疗的反应。由于细胞黏附支持肿瘤的生长和维持，因此测量这种力非常重要，这种力通常在皮牛顿（pN）级别。本文研究了开发一种TGT探针的可行性，该探针在暴露于不同水平的Hela细胞产生的黏附力时能够产生伏安信号。为此，基于预定义的DNA双链结构设计了两种伏安TGT力生物传感器，这些双链结构可以在约12 pN和约56 pN的力作用下被破坏。这些具有约12 pN和约56 pN阈值力的双链结构被附着在覆盖有2D MnO₂纳米酶的电极上。双链TGT覆盖了铜-free laccase模拟纳米酶表面的特定区域，与底物相互作用，从而阻止了由于HQ氧化引起的电子转移。在与宫颈癌细胞孵育90分钟后，12 pN的TGT生物传感器被破坏，导致配体链释放。因此，大部分双链结构转化为单链形式。实验结果表明，随着细胞数量从500个增加到5×10⁶个，电流强度呈线性增加。这种策略能够检测到少至500个黏附细胞产生的牵引力。随着细胞数量的增加，细胞产生的黏附力增强，更多的配体DNA链从电极表面脱落，导致电流强度增加。然而，结果表明，即使更多的HeLa细胞也无法产生足以破坏所设计TGT生物传感器的56 pN的力。由于破坏TGT探针的阈值力较高，所制备生物传感器的响应没有明显变化。这项研究是首次使用基于laccase模拟的2D MnO₂-纳米酶的伏安TGT力生物传感器，该传感器具有宽的动态线性范围（DLR），同时受益于无标记和信号开启的特性。

引言

细胞诱导的黏附力不仅在调节细胞功能（从生长、分裂和细胞分化到信号转导和转录）中起着关键作用，而且还驱动了维持稳态和组织再生所需的拉伸、弯曲和对齐[1]。这种力是癌细胞转移的关键因素，因为它影响癌细胞从原发肿瘤脱离、穿透血液或淋巴管、侵入周围组织并最终形成新肿瘤的能力。另一方面，细胞诱导的黏附力会产生不规则的液体和固体应力，从而促进肿瘤生长和局部侵袭，并削弱对各种治疗的反应[2]、[3]。为此，细胞膜黏附分子（包括整合素、选择素和钙黏蛋白等细胞表面蛋白的子集）通过与目标配体结合并在皮牛顿（pN）级别施加力来介导细胞之间的黏附[4]、[5]。

尽管细胞诱导的黏附力很重要，但测量这种通常在pN级别范围内的力具有挑战性[6]。细胞牵引力显微镜（TFM）作为一种非侵入性光学成像技术已被提出用于确定黏附细胞产生的牵引力，但精确的操作程序和复杂的数据分析限制了其应用[6]。微柱阵列也可以通过测量细胞附着时微柱的偏转来测量细胞产生的黏附力[7]。然而，这种技术存在一些局限性，如柱几何形状的影响、细胞行为、力测量范围、空间分辨率和动态测量等问题。原子力显微镜（AFM）能够检测细胞间的黏附，但由于有效拉动距离不足而应用受限[8]。磁镊子作为一种强大的测量细胞力的技术已经出现，但其设置可能很复杂，特别是对于高力、短牵引实验[9]。此外，这些镊子每次使用前都需要消磁，因为镊子核心的磁滞现象可能会使力测量变得复杂。用于细胞力显微镜的光子晶体提供了一种可视化并量化细胞力的新方法[10]。然而，这项技术在活细胞成像、通量和多尺度分析方面仍面临局限性。与上述技术相比，基于张力探针的生物传感器更具经济性和可访问性。此外，它们具有更高的灵敏度，并且受到的限制较少。DNA张力探针（称为张力计牵引器（TGTs）基于双链模式（DNA双链）设计，用于检测12至56皮牛顿范围内的力[11]。它们在适当的力作用下不可逆地解离，并作为自动测量器来限制受体-配体间的张力[11]、[12]。Duan等人[13]报道了一种基于CRISPR相关蛋白12a（Cas12a）放大的荧光生物传感器，该传感器通过荧光报告链的力驱动催化切割来检测少至50个黏附细胞产生的牵引力。尽管基于荧光张力探针的生物传感器显著提高了细胞诱导黏附力的测定精度，但电化学生物传感器可能更便携、更便宜且更易于使用[14]、[15]。

在我们提出的策略中（图1），一个阈值力约为12 pN的双链TGT被附着在覆盖有二维超薄MnO₂纳米膜（2D Mn-uNF）的电极上（12 pN TGT生物传感器）。MnO₂纳米片不仅作为DNA纳米平台，还作为纳米酶发挥作用。由于cRGDfK配体DNA与HeLa细胞膜上表达的αvβ3整合素结合，导致cRGDfK从12 pN探针（12 pN TGT）上解离，从而使生物传感器能够通过修改后的电极电流增加来检测细胞力。12 pN及以上的牵引力可以触发双链的解离，而12 pN的双链TGT可以承受小于12 pN的力[16]。

αvβ3整合素作为主要的细胞黏附受体，在肿瘤血管生成过程中其表达增加，在癌症转移中起着重要作用[17]。这种细胞表面锚定蛋白参与细胞-细胞和细胞-基质相互作用。研究表明，αvβ3整合素可以在12 pN及以上的力作用下被激活[12]、[18]。在没有HeLa细胞的情况下，双链TGT覆盖了2D Mn-uNF纳米酶（一种高性能的无铜laccase模拟物）的活性位点，从而阻止了由于氢醌（HQ）氧化引起的电子转移。Mn-uNF纳米酶通过单电子转移反应氧化酚类化合物[19]。当TGT双链在HeLa细胞黏附过程中因整合素介导的力而破坏时，观察到电极表面势垒的降低，从而导致电子转移速率的增加。HeLa细胞膜上表达的αvβ₃整合素可以特异性识别TGT传感器上含有RGD基序（cRGDfK）配体的环状五肽，并促进力诱导的细胞黏附。虽然关于基于Mn的laccase模拟物的纳米酶研究较少，但本研究是首次使用结合在2D Mn-uNF纳米酶上的TGT来检测Hela细胞诱导的黏附力。

材料与方法

磷酸盐缓冲水溶液（PBS）由Kawsar Biotech Co.（伊朗）提供。合成寡核苷酸序列由Faza Pajooh Co（伊朗）制备。除非另有说明，所有化学品均从Sigma-Aldrich订购。

2D Mn-uNF纳米酶的制备

2D Mn-uNF纳米酶是使用化学沉淀法随后进行碱蚀刻的方法合成的，该方法由Wu等人之前报道[19]。在所描述过程的初始步骤中，直接在...

2D Mn-uNF纳米酶的显微和电化学表征

Mn-uNF的形态通过扫描电子显微镜（SEM）（ZEISS，德国）进行了表征。如图2A所示，Mn-uNF表现出片状结构，与之前文章[19]的SEM结果一致。在2D Mn-uNF-2-MD固定在GCE表面后，使用SEM对其进行了分析（图2B）。采用EDX（能量分散X射线光谱）来确认O和Mn的存在（图2C）。2D MnO₂的晶体结构...

结论

本策略展示了在伏安生物传感器中使用纳米酶-DNA生物偶联物的前景。将纳米酶与DNA链结合用于制造生物传感器具有一些主要优势：（I）DNA在纳米酶的化学和热力学稳定性中起着重要作用。（II）通过与DNA链的生物偶联可以调节纳米酶的活性，同时DNA也可以用于识别广泛的目标。

CRediT作者贡献声明

Mohammad Ali Farzin：撰写——原始草稿、方法论、研究、正式分析、概念化。Seyed Morteza Naghib：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法论、研究、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。