无需提取的一步法重组酶聚合酶扩增技术——利用狂热火球菌（Pyrococcus furiosus）Argonaute蛋白进行Epstein-Barr病毒（EB病毒）的快速高效检测

《Microchemical Journal》：Extraction-free one-pot recombinase polymerase amplification- Pyrococcus furiosus Argonaute assay for rapid and sensitive detection of Epstein-Barr virus

基于重组酶聚合酶扩增（RPA）和Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）的提取-free单管式检测方法，实现EB病毒的高灵敏度（1拷贝/μL）和特异性检测，适用于现场即时诊断和资源有限场景，检测时间短于1小时。

　　

宋夏|曹娜|郝盼盼|朱琳琦|史伟峰|周伟|吴志云

中国江苏省常州市苏州大学第三附属医院临床实验室

摘要

Epstein-Barr病毒（EBV）是首个被发现的人类致癌疱疹病毒，与多种恶性肿瘤和自身免疫性疾病有关。传统的分子诊断技术（如PCR和qPCR）具有高灵敏度，但需要复杂的核酸提取过程、精密的设备以及训练有素的操作人员，这限制了它们在即时检测（POCT）中的应用。本文报道了一种无需提取、一管完成重组酶聚合酶扩增-Pyrococcus furiosus Argonaute（RPA-PfAgo）检测方法，可用于快速且超灵敏地检测EBV。在该方法中，扩增和检测过程整合在一个封闭的试管内进行：RPA步骤在37°C下进行目标序列扩增，随后在95°C下通过PfAgo介导的切割反应完成。采用石蜡分离技术实现扩增产物与检测产物的分离，从而防止交叉污染并确保操作流程的顺畅性。通过优化RPA-Ago酶用量、引导DNA浓度、Mn2?水平及孵育时间等反应参数，达到了最高的检测效率。该方法的检测限为1拷贝/μL，并且未发现与其他病毒或细菌病原体的交叉反应。使用31份临床血液样本进行的验证显示，其检测结果与qPCR结果完全一致。这项研究首次提出了一种无需提取、仅需一个试管即可完成EBV检测的RPA-PfAgo方法，检测时间仅需一小时。其操作简便、灵敏度高，并且可在蓝光下直接读取结果，非常适合现场检测和资源有限的诊断环境。此外，这一技术为将基于PfAgo的生物传感方法扩展到其他传染病提供了通用平台，为传统的核酸检测方法提供了一种实用且经济高效的替代方案。

引言

Epstein-Barr病毒（EBV），也称为人类疱疹病毒4型（HHV-4），于1964年首次在Burkitt淋巴瘤中被发现，是最早被发现的人类致癌病毒。EBV属于疱疹病毒科（Herpesviridae）中的Gammaherpesvirinae亚科，是一种有包膜的双链DNA病毒，直径约为150–200纳米，基因组大小约为180 kb，编码80–100种蛋白质[1]。EBV感染几乎普遍存在，全球成年人的血清阳性率超过95%，并且会终生存在于B淋巴细胞中[2][3]。除了潜伏无症状携带状态外，EBV还与多种疾病相关，包括淋巴瘤、鼻咽癌、某些胃癌、传染性单核细胞增多症、口腔毛状白斑病、系统性红斑狼疮和多发性硬化症[4]。据估计，EBV每年导致约2%的全球癌症相关死亡病例[5]。

目前已开发出多种EBV检测方法。血清学检测仍被广泛使用，用于监测针对病毒衣壳抗原（VCA）、早期抗原（EA）和核抗原（EBNA）的特异性抗体反应[6]。然而，在免疫功能低下的个体中，由于抗体产生受损或被动获得抗体，血清学检测的可靠性较低，这限制了其在移植受者等脆弱人群中的诊断价值。受影响组织的组织病理学检查是EBV相关疾病（如移植后淋巴增生性疾病PTLD）确诊的金标准，但该方法具有侵入性、耗时且操作复杂[7][8][9][10]。因此，核酸扩增检测已成为EBV诊断的核心方法，能够敏感定量地评估外周血中的病毒载量，从而支持疾病监测和指导预防性治疗[7][11][12][13][14][15]。传统的基于PCR的方法（包括定量PCR qPCR）虽然准确度高，但需要昂贵的仪器和专业的操作人员，限制了其在资源有限或即时检测场景中的应用[16]。近年来，等温扩增技术（如环介导等温扩增LAMP和重组酶聚合酶扩增RPA）被积极探索作为替代方案[17]。其中，RPA因其快速的扩增动力学、较低的操作温度和简单的引物设计要求而受到关注。然而，RPA容易发生非特异性扩增，可能导致假阳性结果并降低分析的可靠性。

为提高检测特异性，过去五年中RPA常与CRISPR/Cas系统结合使用[18][19][20]。这些方法利用序列特异性识别和荧光报告分子的切割，实现高灵敏度的核酸检测。尽管CRISPR基检测方法具有优势，但它们通常依赖RNA引导的核酸酶，这些核酸酶易降解、价格较高且对反应条件敏感。最近，Argonaute（Ago）蛋白作为可编程核酸酶的新选择出现[21][22][23]。Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）是一种可编程的内切酶，能够根据短5′-磷酸化引导DNA精确切割单链DNA[24][25]。与CRISPR系统相比，PfAgo不需要protospacer序列，且由DNA而非RNA引导，具有更高的灵活性和更低的成本。尽管最近的研究表明基于PfAgo的检测方法具有高特异性（甚至可达到单碱基分辨率），但大多数报道的平台仍需多步骤操作，这引发了关于气溶胶污染的担忧，并限制了其在即时检测中的应用[26][27]。

在本研究中，我们开发了一种无需提取、密封在一管内完成重组酶聚合酶扩增-Pyrococcus furiosus Argonaute（RPA-PfAgo）检测的方法，用于快速灵敏地检测EBV DNA（图1）。通过简短的热裂解步骤后，RPA扩增和PfAgo介导的检测过程在空间上被分离，随后通过温度控制整合在一个封闭的试管内完成，实现了无需打开试管即可完成扩增和信号生成。该方法具有高灵敏度和特异性，检测限与qPCR相当，并在临床样本中表现出可靠的性能。由于其简化的工作流程、封闭式扩增-检测设计以及最低的设备要求，这种一管RPA-PfAgo平台为即时检测和资源有限的诊断环境提供了实用的方法。

临床样本和预处理

样本来自苏州大学第三附属医院肿瘤科和血液科的患者，在一年的时间内收集，并储存在-20°C条件下直至分析。本研究采用匿名化的临床样本进行回顾性分析。研究方案已获得苏州大学第三附属医院伦理委员会的批准（批准编号2026–033），并免除了知情同意的要求。

RPA-PfAgo方法原理

RPA-PfAgo检测的整体流程如图1所示。检测过程包括四个步骤：样本预处理、基于RPA的扩增、PfAgo介导的切割以及荧光信号读取。通过对不同EBV亚型的比较分析，选择了一个在大多数EBV序列中都存在的保守片段（位于BamHI-W区域，长度为286 bp）。此外，计算机模拟分析确认了BamHI-W目标区域的高度保守性。

讨论

Epstein-Barr病毒（EBV）由于其致癌潜力以及与多种疾病（从传染性单核细胞增多症到鼻咽癌和移植后淋巴增生性疾病）的关联，仍然是一个重要的临床病原体[29][30]。准确的实验室诊断不仅对临床管理至关重要，也对流行病学监测具有重要意义。长期以来，定量PCR（qPCR）因其高灵敏度而被视为EBV检测的金标准。

结论

总之，我们开发了一种快速、灵敏且高度特异的RPA-PfAgo检测方法，用于EBV的检测。通过将等温扩增与PfAgo介导的切割整合在一个封闭的试管中，该方法实现了真正的封闭系统流程，最大限度地减少了污染并将检测时间缩短至一小时以内。该方法操作简单，不需要复杂设备，并且检测结果可在蓝光下直接观察。

CRediT作者贡献声明

宋夏：撰写初稿、方法设计、概念构思。曹娜：验证、数据整理、撰写初稿。郝盼盼：数据可视化、实验分析、撰写初稿。朱琳琦：验证、软件开发、数据整理、撰写初稿。史伟峰：项目监督、资源协调、概念构思、审稿与编辑。周伟：软件开发、资源管理、项目行政、实验分析、审稿与编辑。吴志云：撰写、审稿

资助

本研究得到了中国博士后基金会（2024M760297）和常州市科技项目（应用基础研究，项目编号CJ20252028）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。