《Microchemical Journal》：Nonenzymatic autonomous assembly of DNA network structures mediated by only one palindromic DNA fragment for miRNA detection
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DNA纳米结构检测系统通过可编程自组装实现肿瘤靶向的miR-21荧光检测，具备高特异性、灵敏度和模块化设计。
熊阳|赵王欣|关炳文|吴登航|任浩宇|胡雪梅|李阳|陈定豪|刘永华|刘子宇|沈志发|李敏
教育部实验室医学重点实验室，浙江省医学遗传学重点实验室，温州医科大学实验医学与生命科学学院，温州生物医学研究院，中国温州325035
摘要
癌症仍然对人类健康构成重大威胁，早期检测与肿瘤相关的生物标志物对于有效诊断至关重要。microRNA-21（miR-21）在多种癌症中经常过度表达，是一个重要的分子指标。在本研究中，通过可编程的自组装过程合理设计并构建了一种DNA网络纳米结构检测系统（DNNS）。DNNS由三个功能模块组成：AS1411适配体链（A1）、淬灭剂修饰链（L1）以及与miR-21完全匹配的荧光标记互补链（C1）。凝胶电泳和系统优化证实，DNNS在生理条件下具有优异的结构稳定性、强烈的荧光响应和高序列特异性。当通过链置换反应识别目标分子时，荧光强度显著增强，从而实现敏感可靠的miR-21定量。初步评估表明该材料具有良好的生物相容性，并具有在生物环境中的应用潜力；然而，本研究的主要目的是展示其强大的检测能力和模块化结构灵活性。总体而言，DNNS提供了一个多功能DNA纳米材料平台，为下一代核酸传感和诊断系统的开发提供了宝贵的见解。
引言
由于核酸纳米材料具有出色的可编程性、结构多样性和生物相容性[1]、[2]、[3]，它们已成为一类快速发展的功能性生物材料。基于序列特异性自组装原理，可以合理设计核酸以形成从简单双链到复杂三维结构的纳米结构，精确控制其大小、形态和空间配置[4]。通过序列优化和结构基元工程（如发夹结构、连接点和G四链体），这些纳米结构可以在特定刺激下发生可预测的构象转变或链置换反应，从而应用于生物分析、疾病诊断和靶向治疗[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。
随着核酸工程的进步，基于DNA或RNA的动态纳米器件已被广泛开发用于生物传感、生物成像和分子诊断[11]、[12]。由于沃森-克里克碱基配对规则的可预测性，核酸探针可以被编程来识别目标序列并触发结构重排或信号放大过程，从而实现微量核酸生物标志物的高灵敏度检测[13]。与PCR、RT-PCR和测序等传统技术相比，基于核酸的检测系统具有设计灵活性、操作简便性、响应迅速以及在活细胞或复杂生物环境中实时分析的适用性等优点[14]、[15]。此外，核酸纳米框架便于集成荧光团、靶向配体和治疗剂等功能组件，为多功能诊断和治疗应用提供了多功能平台[16]、[17]、[18]。
在这些功能组件中，适配体——能够折叠成特定三维结构的合成单链DNA或RNA寡核苷酸——已被广泛用作高亲和力识别元件[19]。借助SELEX技术，已经成功开发出针对蛋白质、小分子和细胞表面受体的适配体[20]、[21]。与抗体相比，适配体具有体积小、化学稳定性高、免疫原性低和易于修饰等优点，使其在生物传感、分子成像和靶向递送应用中具有吸引力[22]、[23]。值得注意的是，AS1411适配体能够特异性识别核仁素，这是一种在许多肿瘤细胞的表面和细胞质中过度表达的蛋白质，因此被广泛探索作为肿瘤靶向配体[24]、[25]、[26]、[27]。
最近，报道了几种先进的基于核酸的miRNA检测策略。例如，锆金属有机框架（Zr-MOFs）与应变促进的叠氮-炔烃环加成（SPAAC）连接的DNA四面体纳米标签的聚集诱导电化学发光（ECL）实现了敏感的miRNA检测[28]。通过DNA功能化纳米孔内的纳米气泡脉冲计数也用于miRNAs的高灵敏度电分析[29]。此外，一种自供电的DNA酶行走器实现了ECL和电化学miRNA检测的双模式生物传感器构建[30]。
尽管这些方法表现出高灵敏度，但它们通常依赖于复杂的化学修饰、金属有机框架、DNA酶活性或精密仪器。相比之下，本研究中开发的DNNS系统通过纯可编程的DNA自组装和趾爪介导的链置换实现了高灵敏度和定量的miR-21检测，无需额外的化学偶联或酶活性。此外，DNNS结合了通过AS1411适配体实现的肿瘤靶向细胞内化以及内在的信号放大功能，能够进行细胞内miRNA成像，并具有药物递送的潜力。与之前报道的系统相比，DNNS提供了一个更简单、模块化且高度可扩展的平台，能够在保持高特异性、灵敏度和操作便利性的同时整合多种功能。
基于这些考虑，我们通过可编程的趾爪介导的链置换反应设计并构建了一种DNA网络纳米结构检测系统（DNNS），其主要目标是实现miRNAs的特异性和信号放大检测。DNNS将动态DNA信号模块与识别元件相结合，提供了一个稳健且模块化的平台，具有高设计灵活性和良好的重复性。为了初步展示该纳米结构在细胞水平上的功能扩展性，将AS1411适配体作为靶向配体进行实验，而与细胞识别和药物装载相关的实验仅作为概念验证。总体而言，这项工作旨在确立DNNS作为高效的miRNA检测平台，并强调其在进一步扩展到多功能核酸基诊断和成像应用方面的潜力。
试剂和材料
本研究中使用的寡核苷酸由上海桑贡生物技术有限公司（中国上海）合成，并通过高效液相色谱（HPLC）纯化。详细的寡核苷酸序列见表S1（支持信息）。DNA储备溶液在1× TE缓冲液（89 mM Tris-硼酸盐，2 mM EDTA，pH 8.3）中制备，浓度为10 μM，并储存在4 °C。低分子量DNA标记物购自新英格兰生物实验室（中国北京）；
DNNS系统的设计与工作原理
DNNS（DNA网络纳米结构检测系统）被合理设计为一种多功能和可编程的核酸纳米器件，用于肿瘤靶向细胞进入和敏感的细胞内miRNA检测。整体设计遵循模块化组装策略，其中不同的DNA组件被赋予特定且不重叠的功能，从而实现靶向、识别和信号转导过程的顺序激活。如图1所示，DNNS系统
结论
通过合理的序列设计和可编程的结构组装，我们成功构建了一种多功能核酸纳米器件DNNS，用于miRNA检测。荧光分析显示，在0.2–120 nM的范围内，信号强度与目标浓度之间存在良好的线性关系，检测限为200 pM。DNNS实现了对miR-21的高灵敏度和特异性识别，在没有
CRediT作者贡献声明
熊阳：撰写——原始稿件，形式分析，数据管理，研究。赵王欣：方法学，软件，撰写——原始稿件。关炳文：资金获取，资源，撰写——原始稿件。吴登航：方法学，软件，撰写——原始稿件。任浩宇：研究，撰写——原始稿件。胡雪梅：项目管理，撰写——原始稿件。李阳：研究，撰写——原始稿件。陈定豪：资源，撰写——原始稿件。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了浙江省新苗人才计划（授权号：2024R413A003）的支持。
