《Mucosal Immunology》：Inhaled
Acinetobacter lwoffii exposure promotes lung PD-L1+ neutrophils and dampens viral-induced type 2 immunity
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本研究聚焦于儿童喘息与哮喘的早期防治难题。为解决病毒感染诱发2型免疫反应导致气道疾病的问题，研究人员探究了吸入农舍微生物Acinetobacter lwoffii（A.lwoffii）对新生小鼠反复RSV感染模型的影响。结果发现，持续吸入灭活的A.lwoffii能显著减轻RSV诱导的肺嗜酸性粒细胞增多、黏液高分泌及Th2反应，其保护作用与诱导PD-L1+表型的肺中性粒细胞密切相关。该研究揭示了环境微生物通过调节中性粒细胞表型以抑制病毒性气道炎症的新机制，为早期生命免疫训练及喘息性疾病的预防提供了新思路。
喘息是儿童时期常见的呼吸道症状，常由季节性病毒感染触发。约30-50%的儿童在生命头三年至少经历一次喘息发作。虽然多数儿童的喘息会自行缓解，但仍有约30%的5岁以下儿童会因病毒感染反复发作喘息，并增加童年期罹患哮喘的风险。有趣的是，大量流行病学研究揭示，农场环境对降低儿童过敏和哮喘风险具有保护作用，而这种保护作用与接触农场微生物密切相关。已有实验研究表明，鼻腔给予来自牛棚的灭活细菌菌株，如Acinetobacter lwoffii（A.lwoffii），可以保护成年小鼠免受过敏原诱导的气道炎症。然而，农场微生物是否以及如何保护机体免受病毒诱导的、与喘息相关的肺部病理损伤，其具体机制尚不明确。这成为了本研究试图解开的核心谜题。
为了探究这一问题，研究人员在《Mucosal Immunology》上发表了一项研究。他们利用先前建立的新生小鼠反复呼吸道合胞病毒（RSV）感染模型，深入研究了吸入冻干灭活A.lwoffii对病毒诱导的免疫反应的影响及其分子机制。研究旨在回答：农场微生物暴露能否抵抗病毒诱导的肺部病变？其背后的免疫学机制是什么？
本研究主要运用了以下几项关键技术方法：建立了新生BALB/c小鼠的反复RSV感染模型，并联合给予鼻内吸入灭活A.lwoffii；通过流式细胞术全面分析了肺部和气道中各种免疫细胞（包括中性粒细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞等）的比例、数量及表型；利用酶联免疫吸附试验（ELISA）和细胞内细胞因子染色检测了肺组织匀浆和免疫细胞产生的关键细胞因子（如IFNγ、IL-5、IL-13等）；对肺中性粒细胞进行了批量核糖核酸测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA），以揭示其转录组特征；并采用FlowSOM聚类分析对中性粒细胞群体进行深入表征。
研究结果
早期生命持续暴露于吸入的冻干A.lwoffii可抑制新生小鼠二次RSV感染诱导的2型免疫
研究人员设计实验，让新生小鼠从出生后第3天到第19天隔日鼻内给予A.lwoffii，同时在第5天和第15天进行初次和二次RSV感染。结果发现，尽管对生长速度无显著影响，但A.lwoffii暴露显著降低了感染小鼠肺部的病毒载量。与单独RSV感染相比，A.lwoffii与RSV联合处理显著减少了肺部及气道的嗜酸性粒细胞数量、嗜酸粒/中性粒细胞比率，以及RSV诱导的黏液高分泌。这表明，持续吸入农场微生物能减轻新生小鼠RSV诱导的嗜酸性粒细胞增多和黏液高分泌。
暴露于A.lwoffii降低了RSV感染新生小鼠的Th1和Th2反应
进一步分析发现，吸入A.lwoffii显著抑制了RSV诱导的1型细胞因子IFNγ和2型细胞因子IL-5、IL-13在肺部的产生。同时，A.lwoffii暴露（无论是否联合RSV感染）偏好性地增加了IL-17A的产生以及IL-17+CD4+T细胞的数量。在病毒特异性应答方面，A.lwoffii抑制了病毒特异性IL-5+和IL-13+CD4+T细胞，但增加了IL-10+CD4+T细胞。这些结果表明，A.lwoffii主要通过影响CD4+T细胞来抑制早期生命RSV感染诱导的1型和2型免疫。
持续A.lwoffii暴露是早期生命最大程度抑制RSV诱导的2型免疫反应所必需的
为模拟流行病学观察到的“早期、频繁、长期”暴露需求，研究比较了不同暴露时长（2次、4次、8次）的效果。结果显示，短期暴露（2次或4次）能部分减少肺部的Th2细胞，但持续暴露（8次）能引起Th2细胞的进一步减少，达到最大的抑制效果。这表明，吸入A.lwoffii对2型炎症的抑制作用并不仅限于初次RSV感染期间T细胞 priming（ priming）阶段，还需要持续暴露才能发挥最佳效果。值得注意的是，持续暴露与肺部中性粒细胞数量的显著增加相关。
早期生命暴露于A.lwoffii诱导的中性粒细胞表现出与RSV感染或中性粒细胞趋化因子诱导不同的表型
通过对比A.lwoffii、RSV以及中性粒细胞趋化因子KC（CXCL1）诱导的中性粒细胞，研究人员发现，A.lwoffii诱导的肺部中性粒细胞数量最多，且其表型与RSV或KC诱导的截然不同。A.lwoffii诱导的中性粒细胞在血液和肺部均表现出CXCR4和CD101等表面标志物的表达降低。这种独特的表型与在受传统农场保护、免于哮喘的阿米什儿童中观察到的循环中性粒细胞表型相似。
A.lwoffii暴露或RSV感染后的差异基因表达和改变的基因应答
对肺中性粒细胞进行RNA-seq分析发现，RSV感染主要上调了I型（IFNα）和III型干扰素应答通路。相比之下，A.lwoffii诱导的中性粒细胞（无论是否联合RSV）转录活性更强，上调了许多与炎症和代谢活性相关的 hallmark（标志性）通路。特别值得注意的是，A.lwoffii特异性地上调了一组与免疫调节相关的基因，其中包括编码程序性死亡配体1（PD-L1）的Cd274基因。
暴露于吸入的A.lwoffii在新生小鼠中诱导了PD-L1+肺中性粒细胞
流式细胞术分析证实，A.lwoffii处理（无论是否联合RSV）在肺部诱导了更多高表达PD-L1、低表达CXCR4和CD101的中性粒细胞亚群（Pop2），而RSV感染则偏向于诱导另一种中性粒细胞亚群（Pop5）。这表明A.lwoffii暴露将具有免疫调节潜能的未成熟中性粒细胞招募到了病毒感染部位。
晚期A.lwoffii干预部分抑制了IL-13+CD4+T细胞并促进了CD101-PD-L1+中性粒细胞的出现
即使在初次RSV感染之后才开始A.lwoffii干预（晚期干预），也能部分减轻RSV诱导的2型免疫反应，包括降低肺部IL-13蛋白水平、减少IL-13+和IL-5+CD4+T细胞数量，并减轻黏液高分泌。这种保护作用同样伴随着肺部CD101-PD-L1+中性粒细胞数量的增加。初步的PD-L1阻断实验表明，鼻内给予抗PD-L1抗体可增强二次RSV感染时的T细胞反应，证实了PD-L1在调节病毒感染免疫应答中的作用。
结论与讨论
本研究系统性地阐明，持续吸入灭活农舍细菌A.lwoffii F78能够缓解新生小鼠病毒（RSV）诱导的气道疾病特征，包括嗜酸性粒细胞增多、黏液高分泌和Th2反应。这种保护作用与肺部及循环中性粒细胞数量的增加密切相关，尤其是A.lwoffii特异性诱导的、具有独特表型（低表达CXCR4和CD101）和转录特征（高表达免疫调节基因如Cd274/PD-L1）的PD-L1+未成熟中性粒细胞的出现。
研究的意义在于：首先，它从机制上解释了农场环境通过特定微生物（如A.lwoffii）暴露预防儿童喘息和哮喘的“卫生假说”的一部分，将流行病学观察转化为了可实验验证的免疫学机制。其次，它揭示了中性粒细胞在早期生命免疫应答中的异质性和复杂性，特别是其作为免疫调节细胞的新角色，而不仅仅是急性炎症的效应细胞。A.lwoffii诱导的PD-L1+中性粒细胞可能通过PD-1/PD-L1通路抑制T细胞过度活化，从而平衡抗病毒免疫与防止有害的2型炎症。最后，研究证明即使是治疗性干预（晚期暴露）也能产生保护效果，这为开发基于环境微生物或其成分的预防或干预策略（例如，用于反复病毒感染诱发喘息的高危儿童）提供了重要的临床前依据。总之，该研究深化了我们对早期生命免疫训练、环境-微生物-宿主互作以及喘息性疾病发病机制的理解，指出了通过靶向中性粒细胞表型来调节呼吸道免疫应答的新潜在途径。
