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本研究应用宏基因组学评估农业废弃地修复造林后的土壤微生物功能恢复情况。研究发现，虽然功能多样性未变，但功能组成在修复地与原始地间差异显著，这与土壤磷（P）含量等遗留效应相关。原始土壤中磷代谢功能多样性更高，表明微生物对贫瘠土壤的适应。研究提示，单纯的植被修复难以完全恢复微生物功能，可能需要针对微生物组（如土壤接种）或直接处理非生物遗留问题（如种植吸磷植物）的干预措施。
文章内容归纳总结
1 引言
在农业废弃地上有效恢复自然生态系统对于应对全球生物多样性下降至关重要。然而，修复工作常面临因耕作导致的土壤结构同质化以及数十年施肥造成的土壤养分遗留等非生物性质改变的挑战。这些遗留效应可能阻碍地上和地下生态系统成分的恢复。因此，评估土壤微生物群落及其生态功能在修复后的恢复情况，为衡量修复干预措施的有效性提供了重要的监测手段。
土壤微生物群落对修复造林表现出复杂的响应模式。一些研究表明，在修复干预数十年后，微生物群落仍未恢复，而另一些研究则更常见地显示出恢复的趋势，尽管这种恢复往往是不完全的。评估微生物群落可以为了解生态演替和恢复轨迹提供线索，但由于微生物类群间存在高度的功能冗余以及类群间存在水平基因转移，群落组成的缺乏恢复并不能直接推断其功能的缺乏恢复。这表明，即使分类学组成未能完全恢复，功能恢复仍可能发生。
越来越多的研究使用基于单基因的扩增子或环境DNA（eDNA）宏条形码技术来评估修复后微生物群落的恢复。然而，由于功能冗余和水平基因转移的存在，仅凭分类学身份无法可靠预测微生物的功能角色，因此这类方法对理解驱动恢复的生态过程提供的见解有限。鸟枪法宏基因组学通过直接测序和量化微生物基因组，克服了这些限制，能够更全面地评估土壤功能潜力及微生物介导的过程，如养分循环、有机物分解和初级生产力。在澳大利亚西南部等养分贫瘠的生态系统中，微生物功能多样性尤为重要，它支持植物-微生物相互作用，并适应磷限制。因此，宏基因组学方法为评估生态系统恢复和恢复力提供了强大的工具。
本研究采用鸟枪法宏基因组学，对澳大利亚西南部六个农业废弃地修复点四种土地条件下的土壤微生物群落及其功能进行了表征。我们测试了以下假设：（i）微生物分类多样性和组成在土地条件间存在差异；（ii）微生物功能基因的组成和多样性在土地条件间存在差异；（iii）与磷循环相关的功能在不同土地条件下表现出不同的恢复模式。
2 材料与方法
本研究在澳大利亚西南部的六个地点进行，该地区属全球生物多样性热点。研究区域为地中海气候，土壤普遍贫瘠。每个地点均包含四种土地条件：从未被清除或耕作的原始植被、被动再生的历史清除地、通过直接播种主动再植被的农用地、以及作为防火带或通道管理的退化地。在每个样地内，系统采集表层土壤样品，用于DNA提取和理化分析。
使用商业试剂盒提取土壤DNA并制备文库，随后在MGI DNBSEQ G400测序仪上进行鸟枪法宏基因组测序。使用Kraken2和Bracken进行物种分类学注释，使用SUPER-FOCUS直接对过滤后的读长进行原核基因功能注释，并参照SEED数据库对功能进行分类。
所有统计分析均在R中完成。使用方差分析比较不同土地条件间的α多样性（有效物种/功能数）。使用基于Bray-Curtis距离的非度量多维标度排序和置换多元方差分析检验群落和功能组成的差异。使用约束对应分析评估群落/功能组成与土壤理化性质之间的关联。针对选定的功能组（特别是磷代谢），采用相同的分析框架，并进行差异丰度和相关性分析，以识别具体的磷代谢功能差异。
3 结果
分析共产生了包含13,940个独特微生物物种的分类学数据库，以及包含35,276个独特功能的功能数据库。物种和功能的α多样性（有效数量）在四种土地条件间均未表现出显著差异。
然而，微生物分类学组成和功能组成均因土地条件和地点而异。特别是在所有功能中，原始土壤和再植被土壤的功能组成表现出明显差异。微生物群落组成与硝酸盐、pH、磷、硫、铝和铁等土壤性质相关，而功能组成则与硝酸盐、pH、磷和硫相关。
在子系统1水平上，氨基酸及衍生物、碳水化合物、基于聚类的子系统、DNA代谢以及调控与细胞信号转导等功能的相对丰度在不同土地条件间存在差异。对于磷代谢功能，原始土壤拥有最高的磷代谢功能多样性，显著高于退化和再植被土地条件。磷代谢功能的组成在不同地点间存在差异，并与磷、硝酸盐、铜、pH和硫等土壤性质相关。尽管可用磷水平在不同土地条件间的差异未达统计显著性，但原始土壤的磷含量普遍较低，而再植被土壤则高出2-3倍。磷代谢功能多样性与土壤磷水平呈中度负相关。
差异丰度分析显示，与原始土壤相比，再植被、退化和再生土壤中两种特定的磷代谢基因（与膦酸盐利用相关的乙酰转移酶和核糖-1,5-二磷酸磷酸激酶PhnN）丰度降低。
对于其他评估的功能组，仅DNA代谢功能组的有效功能数在原始与再植被条件间存在差异。大多数功能组的组成在不同土地条件和地点间存在差异，并与多种土壤非生物性质相关，但关联模式不如磷代谢功能清晰。
4 讨论
研究表明，修复农业景观中的土壤微生物功能是一项重大挑战。我们发现功能α多样性在不同土地条件间一致，但功能组成存在差异，尤其是在再植被土壤和原始土壤之间。这些组成差异与土壤非生物遗留效应（特别是磷的有效性）密切相关。
原始土壤中磷代谢功能多样性更高，表明在养分限制条件下，微生物群落经过长期选择，具备了更广泛的磷获取功能潜力。相反，磷含量较高的再植被和退化土壤中，这些途径的多样性减少，这与微生物倾向于使用能耗较低的无机磷酸盐而非膦酸盐的策略一致。两种参与膦酸盐降解的特定磷代谢基因在修复后土壤中丰度降低，很可能反映了由于残留磷水平较高，微生物从低磷获取策略发生了转变。这些发现表明，尽管原始土壤总体磷功能多样性最高，但微生物群落利用的具体代谢途径在农业后的土地条件下存在差异，这可能影响磷循环动态和长期的生态系统恢复。
我们证实了多种土壤非生物性质与微生物群落和功能组成密切相关。总体功能多样性虽无差异，但细微的组成变化表明，再植被土壤中的功能仍与原始生态系统不同。这些差异不一定反映“缺乏恢复”，而可能代表了在存在未解决的土地利用遗留问题的修复地点，出现了与替代状态一致的、改变了的功能动态。
如果修复项目的目标是完全恢复至原始状态的功能，则可能需要通过有针对性的土壤移植/接种和/或生物刺激策略来解决这些限制因素。此外，未来需要使用基于RNA的宏转录组测序来研究功能表达，并整合多界生物（如真菌）的方法。
磷代谢多样性与可用磷水平之间的强关联表明，农业后的非生物遗留效应持续塑造着微生物功能，制约着长期的养分循环和植物-微生物相互作用。因此，修复工作不应仅关注植被恢复，还应关注促进微生物功能恢复的策略。从原始生态系统引入微生物群落的土壤接种，或通过积聚磷的植物来减少土壤磷含量等干预措施，可能有助于恢复干扰前的土壤条件和功能组成。然而，这些方法的有效性取决于微生物在改变的土壤条件下的定植和持久性，以及开发降低土壤有效磷的实用技术。这些不确定性凸显了进一步研究的必要性，以探索如何克服土地利用遗留效应，并识别农业废弃地景观中微生物功能恢复的生态和非生物限制因素。
