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本文首次揭示了极端风暴（Vaia, 2018）与日常天气波动对濒危金阿尔卑斯蝾螈皮肤微生物群的显著影响。研究发现，风暴破坏区域蝾螈皮肤菌群中的潜在病原菌（如 Aeromonas hydrophila）丰度显著升高，且其细菌群落β多样性（Bray-Curtis dissimilarity）更低。同时，采样时的天气条件（晴天vs降雨）对菌群α多样性（Chao1指数、Faith's phylogenetic diversity）和β多样性（Bray–Curtis、Jaccard等）均有显著影响，解释了最高达9%的细菌群落变异。本研究强调了自然扰动与日度天气变化在塑造两栖动物皮肤微生物群、进而影响其健康与病原体抵御能力中的关键作用，为脆弱物种（如金阿尔卑斯蝾螈）的保护策略提供了重要的微生物学视角。
1 引言
全球生态系统正经历前所未有的变化，两栖动物种群因此遭受由栖息地丧失和新发病原体驱动的灾难性衰退。皮肤微生物群是两栖动物抵御病原体的重要第一道防线。金阿尔卑斯蝾螈（Salamandra atra aurorae, Trevisan, 1982）是一种高度地方性、濒危的两栖动物亚种，其分布范围不超过26 km2。2018年发生的Vaia风暴对包括其整个分布区在内的超过42,000公顷森林造成了严重风倒破坏。本研究首次描述了该亚种皮肤微生物群的细菌和真菌组成，并利用Vaia风暴造成的栖息地扰动作为独特机会，探究极端天气事件与日常天气波动是否会改变其皮肤微生物群的多样性和组成，从而影响其对环境变化的适应力。
2 材料与方法
2.1 极端天气事件：Vaia风暴
2018年10月27日至30日期间，Vaia极端气象事件以近200 km/h的风速和72小时内超过600 mm的降水量肆虐意大利东北部森林。
2.2 研究区域
研究区域位于意大利特伦托自治省（PAT）的Vezzena高原（海拔1450米）。在7.8公顷的森林内设置了33个20米×20米的样地（plot）进行长期监测。根据2018年风暴后是否有树木风倒，将样地划分为“受影响”（impacted）或“未受影响”（non-impacted）。
2.3 环境变量
通过卫星影像和气象站数据，评估了受影响与未受影响样地在空气温度、归一化植被指数（NDVI）和归一化水体指数（NDWI）上的差异。计算了每个样地在风暴前后（2017年与2022年）立木百分比的差异以评估树木损失。
2.4 蝾螈样本采集
2022年7月26、28和29日，共捕获56只金阿尔卑斯蝾螈（44只来自12个未受影响样地，12只来自2个受影响样地）。记录了每只个体的总长度、性别（雄性/雌性/妊娠雌性）等信息。使用无菌水冲洗后，用拭子对每只蝾螈进行全身30次皮肤擦拭采样，并将拭子于-20°C保存。
2.5 分子方法与测序
使用DNeasy Blood and Tissue Kit提取DNA。分别针对16S rRNA基因V3-V4区（细菌）和ITS1区（真菌）进行PCR扩增。扩增产物纯化后，在Illumina MiSeq PE300平台上进行双端测序，每个样本目标覆盖度约10万条reads。
2.6 生物信息学分析
使用DADA2（v.1.16.0）进行序列质控和处理。使用SILVA（v.138.1）数据库为细菌ASV（amplicon sequence variants）分配分类学，使用UNITE数据库（General Fasta v.9.0）为真菌ASV分配分类学。使用decontam包（v.1.24.0）和阴性对照进行文库去污染。使用SRS（scaling with ranked subsampling）方法进行数据标准化。
2.7 统计分析
使用线性混合模型（LMM）测试环境变量在样地类型和Vaia时间点前后的差异。使用LDA效应量（LefSe）方法检测受影响与未受影响样地间皮肤微生物群细菌和真菌属水平的差异丰度。针对潜在病原菌Aeromonas hydrophila，使用Mann-Whitney U检验比较其相对丰度。使用Chao1、Shannon熵、逆辛普森指数和Faith's系统发育多样性指数计算α多样性，并使用广义线性混合模型（GLMM）分析其与样地类型、采样天气、优势树种和性别的关系。使用Bray–Curtis相异度、Jaccard指数以及非加权和加权UniFrac距离评估β多样性，并使用PERMANOVA和PERMDISP进行分析。
3 结果
3.1 环境变量
在所有样地中，风暴后的NDVI（植被覆盖度）显著高于风暴前，NDWI（地表水含量）则显著低于风暴前。但受影响与未受影响样地之间，在空气温度、NDVI或NDWI上均未发现显著差异。与蝾螈不存在的样地相比，蝾螈存在的样地NDWI显著更低（表明环境更干燥）。
3.2 蝾螈样本
捕获的蝾螈数量、性别比、妊娠雌性比例、体重和体长在受影响与未受影响样地之间均无显著差异。
3.3 皮肤微生物群组成
共获得6,596,108条reads，鉴定出12,397个细菌ASV和2,149个真菌ASV。
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细菌：最丰富的门是变形菌门（Proteobacteria，占70.0%），其次是拟杆菌门（Bacteroidota，10.5%）和放线菌门（Actinobacteriota，9.0%）。最丰富的属是Acinetobacter（19.3%）和Pseudomonas（17.1%）。
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真菌：最丰富的门是子囊菌门（Ascomycota，64.4%）和担子菌门（Basidiomycota，22.5%）。最丰富的属是Lophodermium（11.1%）和Cladosporium（6.4%）。未检测到壶菌（Batrachochytrium spp.）。
LefSe分析显示，与未受影响样地相比，受影响样地的蝾螈皮肤微生物群中，5个细菌属（Acidicapsa, Aeromonas, Alloprevotella, Oerskovia, Pseudarthrobacter）和3个真菌属（Herpotrichia, Lachnum, Rhizidium）的相对丰度显著更高；5个真菌属（Exobasidium, Hormonema, Lachnellula, Parafenestella, Piskurozyma）的相对丰度则更低。特别值得注意的是，导致红腿病（red-leg syndrome）的潜在致病菌Aeromonas hydrophila在受影响样地蝾螈中的相对丰度中位数显著更高。
3.4 皮肤微生物群α多样性
样地类型（是否受风暴影响）与细菌或真菌α多样性无显著关联。然而，天气条件显著影响细菌α多样性：在降雨条件下，细菌的丰富度（Chao1指数）和系统发育多样性（Faith's PD）均显著低于晴天条件。真菌α多样性（尤其是群落均匀度，逆辛普森指数）在受影响样地有更低趋势，但在校正协变量后不显著。
3.5 皮肤微生物群β多样性
受影响样地蝾螈的皮肤细菌β多样性（Bray-Curtis、Jaccard、加权/非加权UniFrac）在所有指标上均显著低于未受影响样地，表明其细菌群落组成在个体间差异更小。
天气是影响皮肤微生物群β多样性最强、最一致的因素，最高可解释9%的细菌群落变异和6%的真菌群落变异。细菌β多样性在晴天（包括雨后）更高，而真菌β多样性则在雨天更高。
性别不影响微生物群β多样性。优势树种对真菌群落β多样性有边际效应。
PERMDISP分析表明，天气条件和样地类型显著影响细菌和真菌群落β多样性的离散度（dispersion）。
在整个研究区域内，细菌群落的相似性（基于Bray-Curtis距离）与样地空间邻近性呈显著正相关。而真菌群落未显示出显著的地理结构。
4 讨论
Vaia风暴及日常天气波动均能影响金阿尔卑斯蝾螈的皮肤微生物群。风暴影响区域蝾螈皮肤中潜在病原菌A. hydrophila丰度升高，且细菌β多样性降低（群落同质化），这可能削弱其对病原体的抵抗力并增加疾病易感性。真菌群落的响应模式与细菌不同，部分与腐烂植物材料相关的真菌（如Oerskovia）丰度在受影响区域增加，可能与风暴后木材残骸增加有关。
日常天气（特别是降雨）对微生物群α和β多样性有显著影响，表明微生物群对湿度和降水等瞬时环境因素高度敏感。这可能是由于真菌孢子扩散和细菌在不同湿度条件下粘附能力的差异所致。
尽管未检测到空气温度、NDVI和NDWI在受影响与未受影响样地间的显著差异，但风暴引发的冠层开口、紫外线暴露、蒸气压力亏缺以及土壤成分等微生境变化，可能通过影响环境微生物库或宿主行为间接塑造了皮肤微生物群。
鉴于金阿尔卑斯蝾螈分布范围狭窄、繁殖率低、种群数量自风暴后急剧下降，保护策略应考虑极端天气事件和微气候条件对其皮肤微生物群（作为健康指标）的潜在影响。维持稳定的微生境、足够的湿度水平以及通过可控的森林管理减轻栖息地扰动，可能有助于支持有益的微生物群落，从而增强这一濒危物种的适应力。未来的研究应关注微生物群组成变化是否直接转化为疾病易感性或整体适应性的改变，并将微生物群监测纳入长期保护实践。
