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这篇综述系统介绍了PhyloRef，一个基于Snakemake的、半自动化的系统发育引导工作流，用于提升环境DNA（eDNA）参考数据库的质量。通过整合完整线粒体基因组与单基因序列，结合基于聚类的异常检测（而非严格的单系性要求）与“similar_to=”注释机制，PhyloRef有效识别并处理公共数据库（如NCBI）中存在的注释错误、物种误识别和序列污染问题。其在板鳃亚纲（Chondrichthyes）与辐鳍鱼纲（Actinopterygii）数据集上的验证表明，该工具能高效检测并移除异常序列（如软骨鱼类9条、硬骨鱼类401条），并对模糊系统发育位置的序列进行标注，从而显著提高下游eDNA生物多样性评估的可靠性。未来发展方向包括整合机器学习进行异常检测、纳入核标记以提升分类分辨率，并开发自动化更新模块，为eDNA研究和生态监测提供更稳健的参考数据基础。
1 引言
环境DNA（eDNA）分析因其在生物多样性监测、入侵物种检测和濒危物种保护中的广泛应用而受到广泛关注。然而，当前广泛使用的公共数据库（如GenBank、BOLD）常存在注释错误、物种误识别和序列污染等问题，导致生物多样性评估结果不可靠。现有质量控制方法多依赖基于规则的过滤或系统发育检查，前者可能遗漏系统发育不一致的记录，后者则难以扩展到大规模数据集且缺乏标准化流程。
2 材料与方法
PhyloRef是一个模块化的Snakemake工作流，接受物种名称列表或登录号列表作为输入，包含数据获取、基因提取、序列比对、系统发育树构建、异常检测、人工校订和最终数据库组装七个顺序模块。其核心创新包括：
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数据获取与预处理：支持基于物种名或登录号的批量检索，通过记录级过滤和物种级亚采样平衡分类代表性与数据集规模。
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基因提取：基于GenBank注释提取用户指定的线粒体基因（如COX1、12S rRNA），支持多基因串联用于系统发育分析。
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系统发育分析与异常检测：序列按分类阶元（默认按目）分组后进行MAFFT比对和FastTree系统发育推断。异常检测基于拓扑结构与分类注释的一致性，将异常分为三类：
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类型I（绿色异常）：单一序列在其预期属、科或目级分支外聚类，可能源于注释错误。
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类型II（蓝色异常）：同一物种的两条序列未能聚类在一起，显示不一致的系统发育位置。
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类型III（红色异常）：物种具有三条及以上序列，其中至少一条明显偏离主支系，可能反映种内分歧、数据污染或物种边界模糊。
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人工校订与标签分配：用户可基于PDF树和异常类型进行人工检查，确认错误的序列被移除，而系统发育模糊的序列则记录在similar.txt中，用于后续添加“similar_to=”注释。
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数据库构建与版本控制：最终数据库以GenBank和FASTA格式输出，其中FASTA头文件中会为无法区分的序列组添加“similar_to=”标签，以提示下游分析中存在分类不确定性。
3 结果
PhyloRef在板鳃亚纲和辐鳍鱼纲的完整线粒体基因组数据集上进行了验证。初始检索获得2234条软骨鱼类和16,795条硬骨鱼类序列，经过滤和亚采样后，分别保留389条（269种）和7570条（4957种）序列用于分析。
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异常检测结果：在软骨鱼类中，PhyloRef标记了7条绿色异常、10条蓝色异常和3条红色异常，经人工确认后共移除9条异常序列。在硬骨鱼类中，标记了102条绿色异常、363条蓝色异常和317条红色异常，最终移除401条异常序列。值得注意的是，即使RefSeq（NC_）条目中也发现了错误序列（硬骨鱼类128条、软骨鱼类6条），表明仅依赖元数据验证不足以保证数据质量。
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分类分布与质量评估：对硬骨鱼类前10大科的序列质量评估显示，错误序列（error_seq）比例在1.40%–12.26%之间，模糊序列（similar_seq）比例在4.50%–24.70%之间。其中，Gobionidae、Xenocyprididae和Nemacheilidae等科的问题记录比例较高（约32%、27%和25%）。
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系统发育模糊案例：研究还识别了多组系统发育位置模糊的序列，如Epinephelus bruneus与E. moara、Somniosus microcephalus与S. pacificus以及Carassius属内多个物种，这些案例反映了近期物种分化、线粒体渐渗或不完全谱系分选等生物学过程，而非数据库错误。这些序列被保留并标注“similar_to=”，以提示下游分析中的不确定性。
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最终数据库：校订后的数据库包含380条软骨鱼类线粒体基因组（代表266种）和7258条硬骨鱼类线粒体基因组（代表4887种），所有序列均以标准化格式公开提供。
4 讨论
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系统发育模糊序列的管理：PhyloRef采用保守的“similar_to=”注释策略，既保留了可能反映重要进化过程（如杂交、近期辐射）的序列，又明确提示了分类不确定性，有助于减少eDNA代谢条形码研究中的假阳性鉴定。
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PhyloRef的优势与当前局限：其优势在于利用完整线粒体基因组提升系统发育分辨率，提供结构化的异常分类与“similar_to=”注释机制，并通过分组策略提升计算可扩展性。然而，当前方法仍主要依赖线粒体标记，难以检测核基因渐渗或不完全谱系分选导致的冲突；稀疏的分类采样可能影响推断可靠性；且短eDNA扩增子（~200–300 bp）提供的系统发育信号有限，可能增加异常检测的假阳性。此外，尽管自动化程度提高，专家审查仍是解释模糊案例（如杂交或隐存种复合体）的必要环节。
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未来发展方向：包括整合机器学习模型以提升异常检测性能、纳入核标记（如ITS、18S）以改善复杂进化历史的解析、开发自动化更新系统以维持数据库时效性，以及通过算法优化和并行计算提升大规模数据集的处理效率。
5 结论
PhyloRef通过将系统发育拓扑分析整合到可重复的Snakemake工作流中，为eDNA参考数据库的校订提供了一个实用且可扩展的工具。其在软骨鱼类和硬骨鱼类数据集上的验证证明了其检测错误注释、模糊系统发育位置及潜在生物学信号（如渐渗或不完全谱系分选）的能力。总体而言，PhyloRef有助于提高参考序列质量，帮助研究人员减少注释错误并更自信地解释分类不确定性。
