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这篇研究首次系统比较了环境DNA（eDNA）宏条形码技术与标准化底拖网调查在法罗群岛海域的应用。研究发现，两种方法相结合可将调查到的类群丰富度提升151%，共鉴定出47个鱼类类群。尽管eDNA与区域总生物量呈显著正相关（r=0.91），但在站点或区域尺度上相关性较弱。研究证实eDNA能有效补充传统调查方法，尤其擅长检测小型、稀有种及中上层物种（如玉筋鱼），并揭示了两种方法各自的局限性，为海洋渔业资源管理和生物多样性评估提供了重要的方法学参考。
摘要
环境DNA（eDNA）作为一种研究水生环境中鱼类动态的强大工具有巨大潜力，但其在海洋系统中的定量能力，由于缺乏比较研究而备受争议。本研究在法罗群岛周围的底层渔场，对标准化底拖网调查与环境DNA宏条形码技术（12S）进行了比较。数据采集自六个区域的26个站点。拖网共检测到31种鱼类。纳入分子操作分类单元（MOTUs）使调查类群丰富度增加了151%，达到47个，其中21种为两种方法共同检出，11种仅在拖网中检出，15种仅在eDNA中检出。拖网独有检出与低生物量物种（稀有性）和物种鉴别的技术限制（如平鲉属 Sebastesspp.）相关。eDNA独有检出则与稀有性、体型、网具-行为特征以及中上层物种相关。对于两种方法均检出的类群，总reads数与整个调查区域的拖网生物量呈正相关（r=0.85, q<0.001），但在单个站点或区域尺度上则不显著。考虑技术重复中的随机扩增因素后，全调查尺度的eDNA-生物量相关性得到改善（r=0.91, q<0.001）。玉筋鱼eDNA的区域分布与大西洋鳕的胃含物分析结果一致，这为拖网调查所遗漏的玉筋鱼空间分布提供了信息。总体而言，eDNA宏条形码技术识别出了拖网装备采样不足的小型物种，从而在方法结合时提高了物种丰富度。该研究还强调了eDNA在描述法罗群岛海洋生态系统关键种（玉筋鱼）空间分布方面的潜力，并生成了可靠的物种生物量等级估算。然而，研究也指出了eDNA和拖网在海洋系统中均存在的局限性：（i）低生物量物种的检测；（ii）小空间尺度上的变异性；以及eDNA特有的局限性：（iii）来自中上层和底层栖息地的eDNA信号的垂直混合。
引言
海洋渔业资源的可持续管理是一项重大挑战。拖网调查是评估鱼类种群的标准化技术。然而，商业渔业中高强度底拖网对底栖生态系统的有害影响已被广泛认知数十年，估计每次拖网可清除6%–41%的动物生物量。此外，拖网调查的成本和装备要求必须与其提供的高水平细节以及可执行的时空分辨率相权衡。尽管如此，人们已投入大量努力确保传统采样能够提供可靠的丰度定量估计。队列追踪、年龄、大小和阶段评估模型可用于估计可捕系数，提高调查结果的可解释性。
相比之下，依赖水样的非破坏性采集的环境DNA（eDNA）技术，已成为一种潜在强大且经济高效的海洋鱼类种群评估方法，能够补充现有调查工作。利用水样eDNA研究海洋鱼类种群动态具有显著优势。水样可从现有的标准海洋学调查、小型船只、自主水下航行器和系泊设备中采集，便于评估困难、敏感或生态重要的环境。eDNA技术的应用还通过公民科学项目、被动采样方法、自然生物采样器、自主采样、原位分析和利用存档样本库中的遗留数据得以扩展。
近年来发表了大量综述文章，专门探讨eDNA在水生环境中识别或量化特定鱼类类群的应用。这些文章得出的结论较为一致。首先，eDNA与传统调查方法结合使用，提高了对整体鱼类多样性的估计。传统方法通常低估丰富度，因为群落成员对特定采样网具表现出不同的行为或生物学特征，这体现在不同物种、个体发育阶段和局地环境之间的可捕系数存在差异。其次，目前仍缺乏足够的研究来明确比较eDNA与生物量/丰度指标，以了解eDNA提供鱼类种群定量评估的潜力，特别是在海洋环境中。
由于研究匮乏，宏条形码技术基于eDNA数据描述多种海洋鱼类主要生物量分布，从而为渔业管理政策做出贡献的能力仍在积极讨论中。在此背景下，需要考虑两个嵌套约束：（i）环境eDNA分子库（“分子足迹”）在多大程度上反映了原位鱼类群落；（ii）不同分析方法定量或半定量表示环境eDNA库的能力（技术检测偏差）。“分子足迹”的真实性受一系列复杂因素影响。技术检测偏差则可能由引物特异性、PCR扩增效率、随机性、参考数据库覆盖度和生物信息学严格性等因素引起。这些因素共同作用，理论上混淆了鱼类生物量与eDNA拷贝数之间的稳健定量关系。
尽管如此，越来越多的文献支持在海洋系统中eDNA与鱼类生物量/丰度估计之间存在可重复的定量关系。然而，迄今为止在海洋系统中进行的许多eDNA-拖网研究是基于物种特异性qPCR方法。随后又有少数研究对海洋和河口-沿海环境中eDNA宏条形码与底拖网数据进行了多物种定量比较。这些研究普遍显示出序列相对reads与生物量之间存在强度不一的积极关系。
为了进一步理解eDNA在提供海洋鱼类群落时空分布的多物种信息方面的潜力，需要进行更多的海洋系统研究，专门探讨宏条形码与拖网捕获量之间的定量关系。在此背景下，需要权衡拖网技术的已知缺点与eDNA的潜在局限性。本研究比较了法罗群岛周围标准化底拖网调查的eDNA宏条形码数据与拖网捕获数据，旨在实现以下目标：（i）比较eDNA与标准化拖网对鱼类物种的检测；（ii）识别eDNA和拖网独有的检测结果；（iii）在不同空间尺度上检验序列reads与拖网生物量之间的多物种相关性。
方法
2.1 样本采集
在FAMRI研究调查船Magnus Heinason号上进行春季底拖网调查期间（2018年2月至3月），采集了鱼类捕获物和配对的环境DNA（eDNA）水样。在为期5周、面积约10万平方公里、深度范围约90-500米的调查区域内，共进行了26次配对的eDNA-拖网调查。底拖网在白天进行，持续1小时，船速3-3.5节，使用网目尺寸为135毫米的116英尺箱式拖网。上纲位于海底上方4.5-5米处。渔获物鉴定到种水平，称重，并标准化为单位努力渔获量（CPUE）。
对于eDNA，使用安装在CTD不锈钢框架上的5升尼斯金瓶采集了1.5升海水样本。样本采集的目标深度对应于拖网高度5米，但由于船只运动和天气条件，实际范围在海底以上1.4至8.7米之间。采样在拖网前进行，以避免无意中采集受扰动的沉积物，并最大限度地减少船只污染。
2.2 船上样本处理
船上采取了细致措施以最大限度地减少潜在的污染源。简而言之，CTD和尼斯金瓶用淡水彻底冲洗，并安装在远离拖网甲板的实验室内。在分样前，用20%体积/体积的漂白剂冲洗尼斯金瓶和喷嘴，并用超纯水冲洗。海水被分样到预先清洗过的2升低密度聚乙烯瓶中，放入净化过的板条箱内的双层塑料袋中储存。每个样品瓶冲洗三次，装满1.5升，立即盖紧，放入双层塑料袋中，储存在船上的-20°C冷冻柜中。过滤在岸上进行以尽量减少污染。
当存在大西洋鳕时，对其胃进行取样，12小时内解剖，对猎物进行分类、鉴定和称重。未消化的标本被排除在外，以消除与在拖网中摄食相关的潜在人为影响。
2.3 eDNA样品过滤
返回无菌实验室后，样品储存在与分子实验室工作空间隔离的设施的-20°C冰箱中。样品在单独的湿实验室中处理。样品在室温下解冻，外部用自来水、漂白剂和超纯水清洗。样品通过摇动2分钟进行均质化，并使用蠕动泵以40转/分钟的转速过滤到0.2微米的Sterivex滤膜上。Sterivex滤芯中残留的样本体积用一次性无菌50毫升鲁尔锁注射器推出并封盖。Sterivex滤膜储存在单独的50毫升离心管中，置于-80°C。操作现场空白样以相同方式处理。泵管在样品间用漂白剂和超纯水冲洗。
2.4 DNA提取
使用改良的Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒方案从Sterivex滤芯中提取DNA。所有工作空间和仪器在使用前都用乙醇和RNase清除剂净化。将Sterivex滤膜在室温下解冻，并将其阳螺纹端火焰密封。提取过程按照制造商的说明进行，但有以下修改：将720微升ATL缓冲液和80微升蛋白酶K直接添加到滤芯内部，在旋转振荡器中于56°C孵育2小时。裂解液用1毫升无菌注射器回收，涡旋并离心。随后，将600微升裂解液与等体积的AL缓冲液和乙醇混合，涡旋，离心，并以3×600微升等分试样上样到Qiagen离心柱上。DNA用120微升无核酸酶水洗脱两次，并储存在-80°C。DNA浓度用Qubit荧光计测量，范围从0.16到2.3纳克/微升。
操作现场空白样在巡航的两个不同日期采集，通过用超纯水装满样品瓶来模拟从CTD瓶中采样。此外，在两个不同的日子里，一个样品瓶从罐中装满1.5升超纯水，并在湿实验室中暴露于船舱空气中24小时。提取空白使用干净的Sterivex滤膜按上述方法进行。在PCR板设置中包含一个PCR空白，其中模板DNA被替换为无RNase水。
2.5 宏条形码测序和生物信息学分析
为了扩增eDNA中感兴趣的宏条形码标记，采用了多重测序策略，即在PCR扩增步骤中对样品进行标记，然后在测序前合并进行后续制备。每个样品使用标记引物进行四次技术性PCR重复。使用标记的12S Mifish U引物扩增用于鱼类生物多样性研究的12S标记物。每个PCR反应体系为20微升，包含3微升eDNA模板。在Illumina MiSeq二代测序仪上使用v2化学试剂进行双端测序。
测序后，使用OBITools软件套件进行生物信息学分析的初始步骤。首先，使用 illuminapairedend合并双端reads并进行质量过滤。使用 ngsfilter对样品进行解复用，同时去除引物和标签序列。然后进行长度过滤步骤 obigrep，随后使用 obiuniq对reads进行去重复。使用vsearch中的 uchime-denovo算法去除嵌合体错误。使用SWARM 2.0将序列聚类为分子操作分类单元（MOTUs）。每个MOTU的代表序列通过 ecotag算法使用本地12S MiFish片段数据库进行物种分类学分配。分配给细菌或生命之树根、非脊椎动物物种、陆源污染的序列，以及在对照（空白）样品中存在超过其总reads丰度10%的MOTUs均被去除。
2.6 随机性校正的Reads数
为了解释与单个水样技术重复相关的PCR扩增变异性（随机性）对后续统计分析的影响，我们采用了一种加权方法，根据reads在技术重复间的分布均匀性来缩放每个MOTU的平均reads数。
跨技术PCR重复的扩增均匀性通过Pielou均匀度指数进行量化。在计算S'之前，根据公式对每个技术重复的MOTU丰度进行归一化。随后计算每个MOTU的等效香农指数。计算S'后，根据公式，根据技术重复的一致性对平均MOTU reads进行加权。
2.7 统计学分析
使用相关性分析评估eDNA宏条形码reads与拖网生物量之间的统计关联。除了使用排名表示数据时使用Spearman相关系数外，其他情况均使用Pearson积矩相关系数。应用Benjamini–Hochberg校正对显著性值进行多重比较校正，并相应报告为q值。
使用McNemar检验来评估零假设。检测效应基于对eDNA和拖网方法性能的先验预期，包括：（i）体型（长度）、（ii）栖息地偏好（底层/底层-中层、中层）、（iii）稀有性（站点占用率）、（iv）生物量（拖网）。连续变量的分类界限在补充表S1中给出。“小型”类群定义为那些小于拖网网目尺寸2倍的类群。稀有性基于组合站点占用率定义（如果任一方法检测到则视为存在），定义为少于10%的站点。
结果
3.1 水样的12S宏条形码数据
经过过滤和质量控制的数据集包含1,897,283条reads，分布在109,919个人工序列变体中。使用SWARM2.0聚类后，共生成355个分子操作分类单元，过滤和质量控制步骤进一步将reads数减少到1,887,811条。经过 ecotag算法分类学分配后，MOTUs数量浓缩至总共41个。在整个调查区域最终共记录了1,838,836条reads。分配给每个MOTU的reads数跨越四个数量级。物种在站点中记录的比例范围从0.04到0.96，而在区域中检测到的物种比例范围从0.17到1。总reads数与物种在eDNA样本中被检测到的站点比例和区域比例均呈强正相关。调查区域分为6个不同区域，共采样26个站点。每个区域的reads数从东深区的160,428条到浅滩区的512,996条不等。操作样品空白几乎完全没有来自样本中鉴定的MOTUs的任何reads，唯一的例外是其中一个空白含有2,971条圆鳍鱼（Cyclopterus lumpus）的reads。同样，24小时空气空白对大多数MOTUs呈阴性，尽管它们含有一些在拖网中捕获的最丰富物种的reads。提取和PCR空白对所有MOTUs均为阴性。
3.2 底拖网数据
在底拖网调查中，26个站点共捕获了37,060公斤的总鱼类生物量。单位努力渔获量存在显著的区域变异性。拖网样本中共鉴定出31种鱼类。就生物量而言，最丰富的两种鱼类是大西洋鳕和黑线鳕，它们是仅有的总生物量超过10,000公斤的两个物种。玉筋鱼是拖网数据中代表性最差的物种，总生物量仅为1.1公斤。
3.3 物种丰富度比较
最终的eDNA数据集包含总共35个MOTUs，其中29个在物种水平上得以鉴定。12S序列在每个站点检测到的MOTUs数量从南陆架的13个到北区的22个不等。从底拖网调查中分类出42个类群，其中31个被鉴定为鱼类类群。每个区域鉴定的不同鱼类类群数量从北区的8个到东深区的19个不等。共有类群定义为从拖网和eDNA调查中均鉴定出的类群。共有类群的数量从北区、南区、东陆架区和浅滩区的7个到西区的10个不等。结合eDNA和拖网检测，总共得到47个类群；其中21个为共有，15个为eDNA独有，11个为拖网独有。
在拖网数据中独特鉴定的14种鱼类中，有三种是不同的平鲉属物种，它们在eDNA 12S reads中仅被分类到属水平。其余11个拖网独有类群中，有8个的特点是总生物量低（<12公斤）且在调查区域内站点检测率低。安康鱼在八个拖网站点被检测到，但调查生物量仍然相对较低。eDNA样本独有的鱼类类群其reads丰度与共有物种处于相似的数量级，尽管它们通常也具有较低的站点检测率。具有较高reads丰度和较高站点检测率的独特eDNA检出对应于小型类群，以及中上层物种的罕见检测。
基于先验预期（中上层物种、体型、稀有性和拖网生物量）检验了拖网和eDNA方法在类群检测方面的差异统计学证据。对于中上层物种，eDNA独有的检出数超过了拖网独有的检出数。对于底层和深海中层类群，未检测到方法差异的证据。关于体型，在小型类群中，eDNA独有的检出数也显著多于拖网独有的检出数。在非小型类群中，未发现方法差异的证据。对于稀有类群，eDNA独有的检出数同样显著多于拖网独有的检出数。在常见类群中，未发现方法差异的证据。在仅存在于拖网数据中的类群中，检测到低生物量类群与拖网独有检出（相对于共有检出）之间存在关联。具体而言，在低生物量类群中，拖网独有检出的可能性是共有检出的九倍。
