《European Journal of Immunology》：Curbing Autoimmunity: A New Fab Fragment Targeting CD40-CD40L Halts B-Cell Activation and Differentiation
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本综述创新性地开发了一种靶向CD40L的非PEG化Fab片段Fab20，旨在克服传统抗CD40L抗体因Fc段引发的副作用。研究证实Fab20能以“螺旋桨状”结构与CD40L三聚体结合，有效阻断CD40-CD40L相互作用，并在体外模型中显著抑制人源B细胞的增殖、活化（CD95+）与分化（IgG生成），为系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）等自身免疫病的靶向治疗提供了极具前景的新候选分子。
引言：CD40-CD40L通路——自身免疫病的核心靶点
适应性免疫应答依赖于不同细胞类型间的协调相互作用。其中，CD40与其配体CD40L（又称CD154）的相互作用在B细胞活化与分化中扮演着关键角色。CD40是B细胞及其他抗原呈递细胞（APCs）上的一种共刺激受体，属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族。CD40L则主要表达于活化的T细胞，是一个三聚体跨膜蛋白。当CD40与CD40L结合后，会激活下游涉及TNFR相关因子（TRAFs）和核因子κB（NFκB）的信号通路，驱动B细胞克隆性扩增并分化为浆细胞和记忆B细胞，这对于维持免疫稳态至关重要。
然而，CD40-CD40L轴的失调是多种自身免疫病的重要病理特征。在系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（SS）、类风湿关节炎（RA）和多发性硬化症（MS）等疾病中，该通路的过度激活会导致过度的免疫激活、炎症及自身抗体产生，进而造成组织损伤。因此，抑制CD40-CD40L相互作用一直是治疗自身免疫病极具吸引力的策略。
早期的临床尝试使用靶向CD40L的单克隆抗体（mAbs），如Ruplizumab和Toralizumab，虽显示出疗效，但因抗体Fc段与血小板Fc受体相互作用引发血栓栓塞事件等严重副作用而中止。为避免Fc介导的副作用，同时增强组织穿透性，研究者们转向开发更小的抑制剂，如Fab片段（约50 kDa）。Dapirolizumab pegol是目前唯一进入三期临床试验的靶向CD40L的聚乙二醇化（PEGylated）Fab片段，但其PEG修饰可能降低生物活性并可能诱发抗PEG抗体。因此，开发新型非PEG化的高效应答片段具有重要价值。
结果
1. 小鼠抗人CD40L单克隆抗体及其Fab片段能结合并抑制CD40-CD40L相互作用
研究团队通过免疫小鼠获得了30株小鼠抗人CD40L单克隆抗体（mAbs）。其中，mAb20展现出对CD40L的良好结合能力以及对CD40-CD40L相互作用的优异抑制能力，能将CD40-Fc与活化T细胞上CD40L的结合减少90%以上。
为避免Fc段副作用，研究团队将mAb20重新设计为重组Fab片段，命名为Fab20。实验证实，Fab20保留了与全长抗体相当的结合与抑制能力。在表达CD40L的细胞上，Fab20能够以剂量依赖的方式抑制CD40-Fc与CD40L的结合，半数抑制浓度（IC50）为0.63 μg/mL（约12 nM）。
通过生物层干涉技术（BLI）评估，Fab20与人重组CD40L（rhCD40L）的解离常数（KD）为70 nM，表明其具有高亲和力。
2. 抗CD40L Fab片段与CD40L相互作用的结构分析
利用冷冻电镜（Cryo-EM）技术，研究人员解析了Fab20与CD40L复合物的结构。结构显示，三个Fab20分子以“螺旋桨状”构象结合在一个CD40L三聚体上，空间上部分占据了CD40的结合位点。高分辨率的局部图谱揭示了Fab20主要通过其轻链（LC）与CD40L一个侧环（残基196-202）发生广泛的相互作用，其中包括围绕CD40L Phe201形成的疏水作用以及CD40L Glu202与一个金属离子（可能为镁离子）协调形成的静电作用。
与已发表的CD40结合CD40L的结构对比发现，Fab20的重链与CD40的N端残基（26-32和40）存在空间冲突，Fab20的轻链与CD40的Glu114之间可能存在静电排斥。这些空间和静电的冲突足以在Fab20存在时干扰CD40与其配体的正常结合。有趣的是，Fab20的结合表位不同于已知的抗CD40L抗体（如Ruplizumab、Tegoprubart、Frexalimab）及预测的Dapirolizumab的结合表位，表明它是一种新型的作用机制。
3. 抗CD40L Fab片段在体外能阻止人B细胞增殖
为了评估Fab20在功能上抑制B细胞活化的效果，研究建立了一个共培养系统：将纯化的人初始B细胞与表达CD40L的成纤维细胞（NHDF-CD40L）共培养，并添加必要的细胞因子（IL-2, IL-21, BAFF和IL-4脉冲）以模拟T细胞辅助的B细胞活化环境。
结果显示，在未处理对照组和Fab同型对照对照组中，B细胞在14天的培养期内发生了显著的增殖。而加入Fab20（3.5 μg/mL，约66.5 nM）则完全阻断了B细胞的增殖能力，导致培养孔中B细胞数量显著减少。显微镜观察也直观地证实了Fab20处理组中B细胞的缺失。这种抑制效应呈现剂量依赖性。
4. 抗CD40L Fab片段在体外能抑制人B细胞分化
除了抑制增殖，Fab20还显著影响了B细胞的活化与分化状态。活化的B细胞会迅速上调CD95（Fas）表达，并逐渐上调CD38（主要在浆母细胞和浆细胞上）。在对照组中，B细胞在第4天就有近99%变为CD95+，并在第14天有约28%分化为CD95+CD38+的类浆细胞。而Fab20处理则完全抑制了CD95的上调，并阻止了细胞向CD38+状态分化。
此外，初始B细胞高表达IgD，活化后会下调IgD并可能上调CD27（记忆B细胞和浆细胞标志物）。对照组B细胞在活化后迅速丢失IgD，而Fab20处理则使存活的B细胞保持了高水平的IgD表达，并阻止了CD27的上调，表明B细胞被维持在一种更初始/静息的状态。同样的效应也在包含更多B细胞亚群（如记忆B细胞）的“泛B细胞”共培养中得到验证。
5. 抗CD40L Fab片段能抑制人B细胞抗体产生
B细胞分化的最终功能输出之一是抗体产生。研究检测了共培养上清液中总免疫球蛋白G（IgG）的水平。在对照组中，随着B细胞的分化，从第7天开始IgG产量显著增加，并在第14天达到高峰。相比之下，Fab20处理完全阻断了IgG的产生，第14天上清中的IgG水平相比对照组降低了超过99.9%。
讨论
本研究成功开发了一种新型的非PEG化抗CD40L Fab片段——Fab20。它通过独特的“螺旋桨状”结合模式与CD40L三聚体结合，利用空间位阻和静电排斥机制有效阻断CD40-CD40L的相互作用。Fab20具有高亲和力（KD~70 nM），并在体外功能实验中展现出强大的效力：它能有效抑制人初始B细胞及泛B细胞的增殖、活化（阻止CD95上调、IgD下调）和分化（阻止CD38/CD27上调及IgG分泌）。
与目前处于临床后期的PEG化Fab片段Dapirolizumab相比，Fab20不仅避免了PEG化可能带来的潜在问题（如活性降低、免疫原性），其结合表位也截然不同，这为自身免疫病的治疗提供了另一种可能的作用机制和候选药物。当然，Fab20作为一种新型治疗分子，其体内有效性、安全性（尤其是对T细胞等其他免疫细胞的影响）、药代动力学（半衰期较短，可能需要修饰以延长）以及大规模生产的稳定性等，仍需在未来通过临床前及临床研究进行深入评估。
总之，Fab20代表了一种有前景的、靶向CD40-CD40L轴以治疗自身免疫病（特别是SLE、MS和RA）的新型治疗策略，其作用机制和缺乏Fc介导效应的特点，暗示了其可能具有更佳的安全性。
