1 引言
本研究探讨了微量元素钼（Molybdenum， Mo）在儿童神经发育关键期对基因调控的潜在影响。研究依托“环境暴露与儿童健康结局”（Environmental Exposures and Child Health Outcomes， EECHO）队列，该队列涵盖了美国纽约州雪城低社会经济地位社区的9至11岁欧裔美国（European American， EA）和非裔美国（African American， AA）儿童。此年龄段儿童神经系统发育迅速，对环境压力源（如有毒物质和膳食因素）高度敏感。
钼在人体生物学中主要以钼辅因子（Molybdenum cofactor， MoCo）形式存在，是亚硫酸盐氧化酶、黄嘌呤氧化还原酶和醛氧化酶等多种酶的关键成分。这些MoCo依赖酶参与硫氨基酸代谢和嘌呤分解代谢等核心代谢途径，这些途径与一碳代谢相交织。一碳代谢为DNA甲基化（DNA methylation， DNAm）反应提供甲基供体，如S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine， SAM）。此外，MoCo生物合成本身也与一碳代谢相连：该途径中的关键酶MOCS1A属于自由基SAM超家族，需要SAM作为其催化活性的底物。因此，消耗SAM的条件不仅可能损害DNA甲基转移酶活性，也可能限制MoCo的合成效率。这些相互关联的途径为钼相关代谢与DNA甲基化模式改变之间提供了生物学上合理的联系。临床相关性在于，遗传性MoCo缺乏会导致严重的神经功能障碍，而产前暴露于高水平钼则会损害心理运动发育。
DNA甲基化对神经发育至关重要，并受饮食和压力等因素影响。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor， BDNF）是一种对神经元存活和发育至关重要的蛋白质（即神经营养因子）。BDNF调节神经递质活性，并支持学习和记忆所需的神经可塑性。当非编码的BDNF基因链（BDNF反义转录本， BDNF-AS）上调时，BDNF水平会下降。这种表观遗传控制与自闭症谱系障碍、帕金森病和阿尔茨海默病等神经系统疾病有关。相反，沉默BDNF-AS可改善神经突生长，减少活性氧物种和炎症，具有神经保护作用。抑郁症、精神分裂症、双相情感障碍和自闭症都与早期生活逆境、DNA甲基化改变和BDNF表达有关。
人类主要通过谷物、牛奶、乳制品、豆类和坚果获取钼。尿钼是近期膳食摄入的敏感且无创的标志物，在受控环境中，高达60%的摄入量可能通过尿液排出。由于尿排泄与膳食摄入相关，监测自由生活人群的钼状态相对简单，典型的排泄范围为43.5-90.4 μg/g肌酐/天，反映了近期的膳食消耗。为了探索钼的表观遗传影响，本研究考察了膳食摄入、尿钼排泄、BDNF DNA甲基化、皮质醇水平和认知之间的关联。我们的研究代表了首个已知证据，表明钼可能在儿童BDNF的表观遗传调控中发挥作用。
2 实验部分
2.1 人群与研究设计
生物样本和相关数据来自纽约雪城雪城大学的EECHO队列，这是一项检查儿童环境毒物暴露和亚临床心血管疾病的横断面研究。全年招募从2013年8月1日持续到2017年11月30日。所有程序均获得雪城大学机构审查委员会批准。DNA甲基化分析聚焦于从292名有效尿液样本捐赠者中随机按种族和性别选择的72名儿童。
2.2 DNA提取与纯化
DNA提取由纽约州立大学上州医科大学精神病学遗传流行病学与神经生物学实验室完成。DNA纯化和全基因组甲基化分析由Diagenode Epigenomic Services LLC完成，使用覆盖约850，000个CpG位点的Infinium Methylation EPIC芯片。
2.3 尿钼水平
纽约州卫生部沃兹沃斯中心无机与核化学实验室使用经过充分验证的基于电感耦合等离子体质谱法（Inductively coupled plasma mass spectrometry， ICP-MS）的方法分析尿液样本中的一系列微量元素，包括钼。尿钼值经肌酐校正并以μg/g报告。
2.4 作为应激生物标志物的皮质醇评估
使用Salimetrics皮质醇酶免疫测定试剂盒测量唾液皮质醇浓度（Salivary cortisol concentration， SCC， μg/dL）。我们测量了唾液皮质醇的昼夜斜率以及平均昼夜皮质醇。
2.5 饮食评估
使用自动化自我管理24小时（Automated Self-Administered 24 h， ASA24）膳食评估工具收集两天的儿童饮食数据。通过将食物分类并计算代表性食物的钼含量（μg/g）来估算平均钼摄入量（微克）。
2.6 认知测量
使用考夫曼简明智力测验第二版（Kaufman Brief Intelligence Test， KBIT）测量儿童认知功能（Child cognitive functioning， CCF）。
2.7 DNA甲基化分析
由于资金限制，DNA甲基化分析仅限于292名参与者中具有完整饮食和DNA甲基化数据的72名。为了克服样本量小的限制，我们采用了靶向基因方法，专注于BDNF基因及其反义转录本（BDNF-AS）中的107个CpG位点。数据使用R/Bioconductor中minfi包中的ssNoob进行预处理和归一化。
2.8 统计分析
使用R/Bioconductor中的EpiDISH包通过稳健偏相关估计细胞异质性。从DNA甲基化数据生成了祖先主成分（mPC2和mPC3）以解释DNA甲基化变异的遗传驱动因素。从EPIC注释文件中选择了BDNF和BDNF-AS基因，产生了107个CpG位点用于分析。
使用线性回归模型测试尿钼（自变量，经自然对数转换以减少正偏态）与单个CpG位点DNA甲基化（因变量）之间的关联。模型控制了种族、性别、细胞类型比例（CD8+T、CD4+T、NK、B细胞、单核细胞、中性粒细胞）和遗传主成分（mPC2， mPC3）。应用错误发现率（False discovery rate， FDR）方法对所有测试的107个CpG位点进行多重比较校正，FDR校正后的p值<.05被认为具有统计学意义。
对于皮质醇-甲基化关联，使用带有交互项和Satterthwaite校正的线性回归进行按种族的调节分析。
3 结果
3.1 人口学特征
我们的样本包括45.8%的AA儿童（n= 33）和54.2%的EA儿童（n= 39），性别分布为48.6%女性（n= 35）。参与者平均年龄为10.61岁（SD = 0.94）。平均收入水平为6.61（SD = 2.92），对应于20，000-25，000美元的家庭收入范围。父母平均报告受过一些大学教育（M = 4.84， SD = 1.46），平均职业得分较低（M = 3.35， SD = 2.88），确认参与者属于中低社会经济地位。
3.2 钼的来源
平均每日膳食钼摄入量为134.38 μg（SD = 45.03），与美国人群120–240 μg的范围一致。AA和EA儿童之间的钼摄入量无显著差异。大部分（81.7%）钼摄入来自谷物（22.8%）、牛奶和乳制品（21.4%）、混合菜肴（17.8%）、蛋白质（10.2%）以及甜食/零食（9.6%）。
尿钼排泄量（81.08 μg/g肌酐， SD = 46.14）与预测的排泄量76.9 μg（SD = 30.0）无统计学差异，验证了手动钼估算。经肌酐校正的钼水平反映了膳食摄入（M = 81.0 μg/g， SD = 46.6； r(70) = .24， p = .044）。AA儿童的钼排泄量（M = 68.25 μg/g肌酐， SD = 35.12）低于EA儿童（M = 91.76 μg/g肌酐， SD = 52.43）。11名儿童的尿钼水平至少比平均值高一个标准差，达到此阈值的男孩（n= 9）多于女孩。此外，六名儿童超过平均值两个标准差。
3.3 钼与DNA甲基化
在控制协变量和肌酐后，钼与BDNF和BDNF-AS上的六个CpG位点的DNA甲基化存在FDR显著关联。较高的钼水平与位于BDNF-AS体内的cg04685076位点的DNA甲基化增加相关（t= 4.088， p= .0001， R2= 0.411）。
相反，钼与BDNF基因5'非翻译区（5' untranslated region， 5'UTR）内五个CpG位点的DNA甲基化降低相关：cg06046431（t= -3.735， p= .0003， R2= 0.251）、cg27193031（t= -3.386， p= .001， R2= 0.211）、cg18117895（t= -3.269， p= .001， R2= 0.237）、cg25381667（t= -3.236， p= .001， R2= 0.214）和cg15688670（t= -3.123， p= .002， R2= 0.270）。
在先前的研究中，BDNF 5'UTR区域的DNA甲基化减少与基因转录增加相关，表明钼可能影响BDNF表达。此外，BDNF-AS的DNA甲基化增加可能进一步促进BDNF转录，考虑到BDNF和BDNF-AS之间的相互调节关系。这些发现表明，钼可能通过表观遗传机制在BDNF表达上调中发挥作用。
3.4 DNA甲基化、应激与认知
在控制社会经济地位、种族、性别、细胞类型和多重比较后，BDNF DNA甲基化与儿童认知功能无显著关联，唾液皮质醇浓度与BDNF DNA甲基化也无显著关联。然而，调节分析揭示了种族特异性的交互作用：在AA儿童中，BDNF DNA甲基化在cg23497217位点随着唾液皮质醇浓度水平升高而增加（R2= 0.228， β = 0.524， t= 3.198， p= .003），而在EA儿童中未观察到显著关系（R2= 0.072， β = -0.233， t= -1.604， p= .117）。
4 讨论
4.1 钼与DNA甲基化之间的潜在机制联系
钼在人体生物学中仅作为辅因子MoCo发挥作用，是几种酶正常功能所必需的。虽然这些Mo依赖酶不直接参与一碳代谢，但MoCo生物合成本身与该途径相交。值得注意的是，MoCo生物合成中的关键酶MOCS1A属于自由基SAM超家族，需要SAM作为其催化活性的底物。由于SAM也是DNA甲基化的通用甲基供体，这创造了一种潜在的双向关系。SAM耗竭可能同时损害DNA甲基转移酶活性和MoCo生物合成。此外，由于MoCo依赖酶参与氧化应激调节，并且有强有力证据表明氧化应激可以增加BDNF甲基化，钼状态的改变可能通过氧化途径影响DNA甲基化。这些相互关联的途径为理解钼水平如何影响DNA甲基化模式提供了一个假设但生物学上合理的框架。
尽管尚未建立MoCo依赖酶活性与DNA甲基化之间的直接机制，但我们观察到的尿钼排泄与BDNF甲基化模式之间的关联与这些提出的间接途径一致。通过MoCo依赖途径的钼失调的临床相关性已得到充分证明：遗传性MoCo缺乏会导致严重的神经功能障碍，而过度的产前钼暴露会损害神经发育结果。考虑到所涉及的复杂相互作用以及对钼对DNA甲基化和基因表达影响的有限理解，我们的研究具有重要意义，因为它提供了将钼状态与BDNF位点的表观遗传调控联系起来的第一观察证据，该基因对神经系统发育至关重要。
4.2 钼的来源
我们研究人群的平均每日钼摄入量在美国普通人群报告的范围内。与先前研究一致，近25%的膳食钼来自谷物和谷物制品，而牛奶和乳制品贡献了另外20%，占总热量摄入的很大一部分。尽管AA和EA儿童之间的钼摄入量没有显著差异，但AA儿童的钼排泄量显著较低，表明生物保留率较高。这可能反映了群体之间MoCo依赖酶活性或代谢需求的差异。值得注意的是，我们还观察到皮质醇与BDNF甲基化之间关系的种族特异性差异，表明多种因素可能导致该人群应激反应和表观遗传调控的种族差异。
钼排泄迅速，全身半衰期约为1-2周。仅通过饮食很少达到毒性水平。在我们的研究中，11名儿童的尿钼水平至少比平均值高一个标准差，六名超过两个标准差。然而，没有参与者超过毒性阈值（1，100 μg/天）。尽管如此，该队列的平均摄入量是9-13岁儿童推荐每日摄入量（34 μg/天）的5.3倍。我们的研究无法解释尿钼水平升高的儿童潜在的环境钼暴露，这可能解释了一些儿童观察到的尿钼水平升高。钼通过汽油发动机燃烧、焚化炉和火葬场释放到环境中，但研究区域没有设施报告钼空气排放或废物释放。未来的研究应检查膳食和环境钼来源，以更好地了解它们对神经发育和表观遗传调控的影响。
4.3 钼与BDNF甲基化之间的关联
我们的研究聚焦于低社会经济地位儿童，这是一个面临粮食不安全、认知差异和前额叶皮层功能障碍风险的人群。尽管我们没有发现钼对儿童认知功能的直接影响，但观察到的与尿钼排泄增加相关的BDNF甲基化变化表明，钼可能影响对神经元可塑性至关重要的BDNF的调控。这是重要的，因为先前的工作表明，DNA甲基化介导的BDNF表达调控影响神经元发育、可塑性和对压力的适应。BDNF表达改变也与压力相关的精神障碍有关，突出了其作为神经和精神疾病新疗法靶点的潜力。
饮食模式，如食物限制、高脂肪饮食、禁食和时间限制喂养，都被发现通过DNA甲基化表观遗传地调节BDNF表达。此外，许多维生素，包括叶酸、B12、B6、胆碱和蛋氨酸，在甲基化途径中起关键作用。虽然其他必需矿物质已被证明可以调节表观遗传过程，但在此研究之前，没有支持性证据表明钼可能发挥类似作用。
我们强调，我们的研究确定了钼状态与BDNF甲基化之间的关联，而非因果或直接的酶促机制。钼对DNA甲基化的任何影响都必然通过MoCo依赖的酶促途径发生，尽管具体机制仍有待阐明。尽管如此，我们的发现仍然有助于越来越多的证据表明，早期生命营养因素，包括必需矿物质摄入，会影响DNA甲基化和基因表达，并对神经发育产生潜在的长期影响。
我们观察到的甲基化变化方向（即BDNF 5'UTR位点甲基化降低和BDNF-AS甲基化增加）都与BDNF转录活性增加一致。然而，我们没有在本研究中测量BDNF蛋白水平或mRNA表达，这限制了我们确认这些表观遗传变化的功能后果的能力。此外，虽然我们探索了钼、BDNF甲基化和应激生物标志物之间的潜在关系，但我们没有发现钼水平与皮质醇之间的直接关联，表明这些是影响该人群BDNF调控的独立因素。
4.4 BDNF甲基化、种族与皮质醇
虽然我们的研究发现钼与BDNF甲基化模式之间存在关联，但我们没有观察到钼与皮质醇水平之间的直接关系。然而，我们探讨了BDNF甲基化本身（无论钼状态如何）是否与皮质醇调节有关，因为BDNF在应激反应途径中起关键作用。我们之前曾注意到我们研究队列中AA儿童的唾液皮质醇浓度升高，这是低社会经济地位儿童常见的应激生物标志物。我们的研究结果表明，升高的皮质醇水平也可能不成比例地影响AA儿童中BDNF基因的表观遗传沉默，对抑郁和其他神经系统疾病的易感性具有潜在影响，使其成为进一步研究的重要领域。
5 结论
这项研究首次证明儿童尿钼排泄与BDNF和BDNF-AS基因内特定CpG位点的DNA甲基化模式改变之间存在关联。较高的钼水平与BDNF 5'UTR区域五个CpG位点的甲基化降低以及BDNF-AS基因体内一个位点的甲基化增加相关。由于BDNF 5'UTR区域的甲基化减少和BDNF-AS甲基化增加都与BDNF蛋白表达增加相关，这些模式表明钼状态可能在发育关键时期影响BDNF基因调控。然而，需要进行功能研究来确认这些甲基化变化是否转化为BDNF蛋白水平的改变和神经发育结果。
除了早期发育，膳食钼还通过其在β-淀粉样肽抑制和氧化应激调节中的作用，与阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关。考虑到营养在DNA甲基化模式、“表观遗传记忆”和压力下神经保护中的更广泛作用，我们的研究结果表明，充足的钼摄入可能支持大脑健康，尤其是在生命早期。
谷物和乳制品是钼的关键膳食来源，可能在支持社会经济弱势人群的神经发育方面发挥保护作用。这些人群通常面临更大的环境压力源暴露，如污染、粮食不安全、枪支暴力和不良童年经历，所有这些都可能对认知功能和神经发育产生负面影响。此外，这些因素与智商差异和前额叶皮层功能障碍有关，这可能损害自上而下的处理和情绪调节。因此，加强粮食安全和获得富含钼的食物可能对中低社会经济地位儿童的神经发育产生显著益处。
虽然膳食钼对BDNF表达和神经发生似乎是必需的，但也应仔细监测过度的环境暴露。与锰类似，锰调节BDNF表达，但过量时会导致认知、运动和行为障碍，如果暴露超过生理需求，钼也可能产生有害影响。鉴于某些城市地区存在钼过度暴露的证据，未来的研究应探索环境钼暴露的潜在风险及其对基因调控和神经健康的长期影响。我们的发现突出了钼排泄、基因表达和种族之间复杂的相互作用，强调了需要进一步研究以阐明钼在健康和疾病中的作用。
5.1 局限性与未来方向
本研究的局限性包括横断面设计，无法进行因果推断；缺乏BDNF蛋白或mRNA测量，限制了功能后果的解释；以及无法区分钼水平升高儿童的膳食和环境钼来源。未来需要结合BDNF表达测量、MoCo酶活性测定和全面钼暴露评估的纵向研究，以阐明这些关联背后的机制及其对神经发育的影响。
