《Genes, Brain and Behavior》：Calorie Restriction Effects on Aging, Learning Performance, and Transcription in Aged Aplysia californica
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本研究通过对比自由取食（AL）与热量限制（CR）饮食下的加州海兔（Aplysia californica），揭示了CR不仅延迟了由反射行为定义的生物衰老，还能在年老个体中维持特定的学习能力（如学习食物不可食，LFI）。研究结合行为学与转录组学分析发现，CR条件下的年老动物其学习表现与年轻个体相当，且学习行为（LFI）后神经元（特别是运动与中间神经元）中富集了与记忆巩固相关的基因通路（如蛋白激酶C结合GO:0005080、钙粘蛋白结合GO:0045296、微管切割ATP酶活性GO:0008568以及神经活性配体-受体相互作用ko04080等）。这些结果表明，CR可能通过调节神经元的结构与功能相关基因表达，延缓了大脑衰老相关的认知衰退，为理解营养干预延缓神经功能退行提供了新的视角。
文章内容归纳总结
1 引言
热量限制（CR）已被证实是延长多种生物寿命最成功的实验干预手段，从酵母、秀丽隐杆线虫、果蝇到部分灵长类动物均有报道。伴随寿命延长的，还有体脂减少、代谢率降低、氧化损伤减轻、自噬增强、炎症减少等一系列生理效应。目前尚不清楚CR是启动了促进延寿的生理效应，还是通过减缓生物衰老过程本身起作用。
生物衰老不同于时间年龄，它指的是个体衰弱和机能丧失的速率，可通过DNA甲基化等分子生物标志物或握力、步速等体能指标来衡量。在加州海兔（Aplysia californica）这种神经模型生物中，生物衰老可以通过已知年龄动物的反射行为（如翻正反射和尾部收缩反射）时间来测定。
与寿命延长相比，CR对学习能力的提升作用研究较少，但已有研究表明CR能提高老年啮齿动物和部分人类试验的学习表现，并伴随着NMDA和AMPA离子型谷氨酸受体的增加、神经元损失的减轻、突触效能增强以及与神经可塑性相关的基因（如脑源性神经营养因子BDNF、胰岛素样生长因子1等）表达增加。类似地，尚不清楚CR是促进了增强学习表现的生理变化，还是减缓了大脑衰老。
本研究旨在检验，在生物衰老被CR延迟的、年老的加州海兔与其年轻兄弟姐妹相比，认知表现是否得到提升。研究结果在年老CR海兔中未发现认知能力的增益或损失，表明认知能力在衰老过程中得到了维持，这与自由取食（AL）的老年海兔出现的多种认知变化迹象形成对比。基因表达结果在很大程度上支持了这一观点。
2 材料与方法
2.1 动物饲养与反射行为
研究使用来自同一卵块的同时雌雄同体加州海兔兄弟姐妹。在孵化后5个月，动物被分为四组饲养笼，其中两组（200只）接受自由取食（AL）饲养，另外两组（200只）接受热量限制（CR）饲养，CR组的食物供应量为AL组的60%。两周后，两种饮食中都加入了10%的石莼属藻类。在6个月大时，部分动物被转移到模拟自然栖息地水流环境的“运动”饲养环境中。动物的生物年龄阶段通过测量其完成翻正反射（TTR）和尾部收缩反射（TWR）的时间来确定，这些反射行为从9-11个月龄开始每月测量。
2.2 CR判定
动物进入“运动”饲养环境后，CR组的投喂量调整为每周每笼5只动物总重量的65%。AL组则持续供应食物。每周对动物称重并计算CR组下周的投喂量。通过监测CR组的生长曲线、观察是否有痛苦行为（如自发喷墨），以及对足部肌肉组织进行近似分析和脂肪酸谱分析，来确保CR的实施未导致营养不良。分析结果显示，CR组与AL组肌肉组织成分差异微小，表明CR动物并未营养不良。
2.3 学习食物不可食（LFI）
动物在其生命周期的两个时间点进行LFI训练：训练时间1（TT1，年龄7-9个月）和训练时间2（TT2，年龄10个月）。LFI训练时，将装有石莼的网探针呈现给饥饿48小时的动物，记录动物将探针含在口中的总时间（TTIM）。如果第一天TTIM > 100秒，则在禁食26小时后进行第二天的回忆测试。学习表现的衡量指标是第二天相比第一天节省时间的百分比（%SAV）。只有获得正%SAV（+%SAV）的动物被认为成功建立了LFI的长期记忆（LTM），并用于后续的行为比较、TWR习惯化训练和基因表达分析。负%SAV或第一天未达到标准的动物被排除。
2.4 尾部收缩反射（TWR）的习惯化
在完成LFI第二天测试后，对获得+%SAV的动物进行TWR习惯化训练。测量动物收缩前后的长度，以收缩长度占初始长度的比例作为TWR幅度。在习惯化训练前后分别测量三次作为基线（前测）和测试（后测），习惯化训练包括50次尾部轻触。
2.5 统计分析
使用夏皮罗-威尔克检验数据正态性，随后根据数据类型选择克鲁斯卡尔-瓦利斯检验、威尔科克森秩和检验、双向方差分析、学生t检验或配对t检验等，并进行邦费罗尼多重检验校正。寿命差异使用卡普兰-迈耶生存分析。
2.6 RNA测序
在LFI第二天回忆测试后2小时，处死获得+%SAV的动物以及未训练的对照动物（禁食76小时以匹配LFI测试动物的禁食时长），取其部分口神经节（包含许多参与LFI的中间神经元和运动神经元）进行RNA提取。使用Illumina NovaSeq 6000进行双端测序。
2.7 主成分分析与差异基因表达分析
使用DESeq2进行主成分分析（PCA）和差异基因表达分析。构建的统计模型包含三个自变量：时间年龄（TT1或TT2）、LFI训练状态（未训练U或训练T）和饮食（AL或CR），并添加了代表所有因子水平完全交互作用的交互项。通过Wald检验识别差异表达基因（DEG），筛选条件为校正p值 < 0.05。共进行了六组比较。
2.8 层次聚类分析
对所有DEG进行正则化对数变换和缩放，然后使用pheatmap进行层次聚类分析，观察样本如何根据自变量聚类。
2.9 基因本体论与KEGG通路富集分析
使用clusterProfiler对六组比较的基因集进行基因集富集分析（GSEA），以识别显著富集的基因本体论（GO）术语和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路。显著性术语经过q值过滤（q > 0.80的术语被移除）。
2.10 差异转录本使用分析
使用DRIMSeq和stageR分析差异转录本使用（DTU），以推断可能发生的亚型转换或选择性剪接事件。
3 结果
3.1 用于LFI的衰老阶段划分与反射行为
根据反射行为时间，AL动物在7个月大时（TT1开始时）已达到性成熟阶段，并在10个月大时（TT2开始时）进入最衰老阶段AII。而CR动物在TT2时仍处于性成熟阶段，比AL动物年轻两个衰老阶段，这表明CR显著延迟了行为衰老。这种延迟持续了约1个月。
3.2 生命与死亡
AL动物在实验开始后的每周称重中均显著重于其CR兄弟姐妹。然而，CR并未显著影响本研究中动物的寿命，最终一只CR动物比最后一只AL动物早16天死亡。
3.3 营养分析
足部肌肉组织的化学成分分析结果显示，CR组与AL组之间差异微小，表明CR动物并未出现营养不良。
3.4 学习食物不可食（LFI）
在LFI学习中，AL动物在TT2的表现（%SAV）显著优于TT1，部分TT2 AL动物甚至在第二天完全不尝试摄取探针，实现了100%的节省率。而CR动物在TT1和TT2之间的%SAV没有差异，表现稳定。TT1 CR动物在第一天表现出更多的摄取尝试、更长的TTIM和总耗时，提示它们可能比AL动物更饥饿，但这种现象在TT2 CR动物中未出现。
3.5 尾部收缩反射（TWR）的习惯化
如预期，TT1 AL海兔能习惯化TWR，而TT2 AL海兔则不能。相比之下，所有在TT1和TT2测试的CR海兔都成功习惯化了其TWR，表明CR延缓了与TWR习惯化能力丧失相关的神经功能衰退。
3.6 基因表达结果
主成分分析（PCA）表明，时间年龄是导致口神经节样本基因表达差异的最大驱动因素，解释了27%的方差。饮食是另一个显著但影响较小的驱动因素，解释了3%的方差。LFI训练状态未显示出显著的全局基因表达差异。
差异基因表达分析结果显示，各比较组中差异表达的基因数量不多。其中，年龄CR（TT2UCR vs. TT1UCR）动物显示出最大的基因表达差异。值得注意的是，有七个基因在年轻的AL动物LFI训练后下调，而在年轻的CR动物LFI训练后上调，其中六个在年老的AL动物中也上调，表明饮食和年龄对这些基因的表达有交互影响。层次聚类分析支持PCA的结果，显示样本首先按时间年龄聚类，然后按饮食，最后按LFI状态聚类。
基因集富集分析（GSEA）揭示了与年龄和LFI相关的功能变化。在年老的AL动物（Age AL）中，与神经元发育（如轴突发生GO:0007409、轴突导向GO:0007411）相关的GO术语被抑制，而与维持细胞极性（如双极细胞极性建立或维持GO:0061245）和细胞粘附相关的GO术语被激活，这反映了年老神经元为维持功能所做的努力。这些变化在年老的CR动物（Age CR）中未显著富集，表明CR可能延缓了这些与衰老相关的转录反应。
在年老的AL动物进行LFI训练后（LFI aged AL），富集了与突触重塑和记忆巩固相关的GO术语，包括微管切割ATP酶活性（GO:0008568）、钙粘蛋白结合（GO:0045296）和蛋白激酶C结合（GO:0005080）。这些术语未在单纯的Age AL中富集，提示它们是由LFI学习行为特异性诱导的。此外，神经活性配体-受体相互作用（ko04080）和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成（ko00290）这两个KEGG通路也在LFI aged AL中显著富集并激活，后者与学习能力的提高有关。
差异转录本使用（DTU）分析发现，在Age AL动物中，复合蛋白（complexin）和原肌球蛋白-2（tropomyosin-2）存在显著的亚型使用差异；在LFI aged AL动物中，septin-11存在显著的亚型使用差异。这些基因分别与神经递质释放、肌动蛋白丝稳定/突触受体运输以及神经元细胞骨架/GABA能突触相关。值得注意的是，在Age CR或LFI aged CR动物中未检测到这些基因的显著DTU，这可能与CR动物不同的学习表现模式有关。
4 讨论
尽管本研究未观察到CR延长加州海兔的寿命，但通过反射行为、两种不同的学习测试以及基因表达结果均证实CR延迟了生物衰老。CR动物在年老时仍能习惯化TWR，且在LFI学习中表现稳定，没有出现像AL动物那样的年龄相关变化（AL动物在年老时TWR习惯化失败，但LFI回忆能力反而增强）。这种不同行为模式的老化差异，可能源于控制尾部收缩和口器进食的神经回路以不同速率衰老，或者日常使用的进食回路因“用进废退”而得到一定保护。
基因表达结果从分子层面支持了行为学发现。PCA和层次聚类均表明，时间年龄是基因表达最大的变异来源，饮食的影响较小但显著，而LFI训练本身并未引起全局性的基因表达变化。然而，通过GSEA进行的通路分析揭示了更细微的功能变化。年老的AL动物表现出与神经元发育抑制和细胞极性维持增强相关的转录特征，这可能是一种代偿性努力，以对抗衰老相关的功能衰退。CR似乎延缓了这些转录反应的出现。
更重要的是，在年老的AL动物进行LFI学习后，其神经元中富集了与突触结构重塑（微管切割、钙粘蛋白结合）和信号传导（蛋白激酶C结合）相关的通路，这可能是其LFI回忆能力增强的分子基础。这些变化可能促进了突触连接的修剪与重建，从而巩固记忆。同时，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成通路的激活也与更高的学习能力相关。DTU分析进一步提示，在衰老和学习过程中，特定神经功能相关基因（如complexin、tropomyosin-2、septin-11）可能通过亚型转换来调节其功能，而这些转换在CR条件下并未发生，或模式不同。
综上所述，本研究在无脊椎模型加州海兔中证明，热量限制能够延缓由行为和转录组定义的生物衰老进程，并在衰老过程中维持特定的认知功能（如反射习惯化）。其分子机制可能涉及对神经元发育、突触可塑性以及氨基酸代谢等相关基因通路的调节。尽管CR对寿命的影响在本研究中不显著，但其对“健康寿命”特别是神经功能维持的积极作用，为理解营养干预如何对抗年龄相关的认知衰退提供了有价值的见解。未来需要通过功能验证实验（如基因敲低或过表达）来进一步阐明这些转录变化在行为表现中的具体作用。
