链霉素诱导的Erwinia pyrifoliae持久细胞的特征分析

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Characterization of streptomycin-induced persister cells in Erwinia pyrifoliae

抗生素持久性机制在植物病原菌Erwinia pyrifoliae中的研究，发现其通过非遗传性持久细胞存活，呈现双相杀菌动力学，转录组分析揭示毒-抗毒素系统、全球应激调节因子及膜稳定因子的协同激活，为果园管理提供新靶点。

　　

林赫 | 俊明宇

韩国大田忠南国立大学应用生物学系

摘要

抗生素持久性是指一小部分细菌在暴露于致命剂量的抗生素后存活下来的短暂生理状态，而这些细菌并未获得遗传抗性。这些持久细胞越来越被认为是反复感染的主要原因。Erwinia pyrifoliae是导致苹果和梨黑梢病的病原菌，对果实生产构成了严重威胁，然而其在抗生素压力下的持久能力仍知之甚少。本研究证明，E. pyrifoliae在暴露于致命浓度的链霉素后会产生非遗传性的持久细胞。杀灭实验显示其具有特征性的双相存活模式，而耐受性实验表明，与正常细胞群体相比，持久细胞在抗生素和氧化应激条件下表现出显著增强的存活能力。转录组分析发现了一种与持久性相关的转录程序，其特征是毒素-抗毒素系统、全局应激反应调节因子和休眠相关通路的强烈诱导，同时生长和代谢相关功能受到抑制。这些结果确立了抗生素持久性作为E. pyrifoliae在链霉素压力下的生存策略，并为解释果园中疾病复发和零星黑梢病爆发提供了机制框架。所识别的通路代表了改善抗生素压力下植物病原菌管理的潜在分子靶点。

引言

抗生素持久性是指一小部分细菌在暴露于致命剂量的抗生素后存活下来的短暂生理状态，而它们并未获得可遗传的遗传抗性[1]。这一现象最初由Bigger[2]描述，持久细胞通常进入非生长或缓慢生长的状态，从而对包括抗生素处理在内的各种环境压力具有耐受性。持久细胞的形成可以是随机发生的，也可以由外部压力信号诱导[3]。重要的是，这种表型是可逆的；一旦压力消失，持久细胞会恢复生长并再生出一个与亲本菌株具有相似抗生素敏感性的群体[3],[4]。这种可逆的耐受性与治疗失败、反复感染和慢性疾病有关，因此对人类和农业疾病管理构成了重大挑战[5]。

虽然抗生素持久性在人类和食源性病原体中已被广泛研究[6]，但在植物病原菌中的相关性直到最近才受到关注。越来越多的证据表明，持久细胞会导致疾病复发和农业系统中化学控制措施效果降低[7]。迄今为止，仅在少数植物病原体中报告了类似持久细胞的状态，包括Erwinia amylovora[8]、Pseudomonas syringae[9]、Xanthomonas citri[10]和Xylella fastidiosa[11]。此外，植物病原菌中持久细胞形成的分子机制仍不完全清楚，尽管一些研究揭示了跨细菌物种保守的转录特征，这些特征与细菌休眠和持久性相关[12]。

Erwinia pyrifoliae是导致韩国苹果和梨黑梢病的病原菌[13],[14],[15]。受感染的树木表现出枝条和花朵的深棕色坏死，通常伴有果实提前脱落[13],[15]。自1999年首次报道该病原体以来，E. pyrifoliae已给韩国的苹果和梨生产造成了巨大的经济损失[14],[16]。此外，最近有报道指出该病原体也在荷兰和美国感染了草莓，导致花枯病和果实腐烂[17],[18]。链霉素被广泛用作控制E. pyrifoliae和E. amylovora引起的黑梢病和火疫病的主要手段[8],[19],[20]。尽管在关键感染期间反复进行了预防性应用[21]，但疾病复发仍然时有发生。值得注意的是，全国范围内的监测仅在一个E. pyrifoliae分离株中发现了链霉素抗性[22]，这表明除了稳定的遗传抗性之外，其他因素也可能导致治疗失败。

基于此，本文假设抗生素持久性可能使E. pyrifoliae能够在链霉素处理下存活并导致疾病的反复爆发。本研究旨在通过RNA测序来表征E. pyrifoliae中由链霉素诱导的持久细胞，探讨其表型耐受性、毒力潜力以及全局转录反应。通过确定这种植物病原体持久性的分子和生理基础，本研究为了解细菌在抗生素压力下的生存策略提供了新的见解，并确定了改善果园黑梢病管理的潜在靶点。

部分摘录

细菌菌株和培养条件

本研究使用了Erwinia pyrifoliae菌株YKB12327。该菌株被广泛认为是黑梢病的代表性菌株，最初于2015年从受感染的苹果树中分离出来[23]。常规培养时，将菌株划线接种到Luria–Bertani（LB）琼脂平板上，并在28°C下培养12小时。之后，将单个菌落转移到10 mL的LB肉汤中，在28°C下以180 rpm的速度振荡培养12小时。

对于持久细胞的诱导实验，使用过夜培养的菌株...

链霉素处理诱导E. pyrifoliae形成持久细胞

为了评估E. pyrifoliae YKB12327是否在链霉素作用下形成持久细胞，研究了其在致命剂量抗生素处理下的存活动态。确定YKB12327的链霉素最小抑菌浓度（MIC）为15.6 μg/mL（图1A）。基于此值，使用50或100 μg/mL的链霉素对指数生长期培养物进行了时间-杀灭实验。两种处理都产生了双相的时间-杀灭曲线（图1B）。在暴露的前3小时内，活细胞...

讨论

持久细胞的特点是具有双相的时间-杀灭动力学，并表现出增强的应激耐受性和非遗传性的抗生素耐受性[5]。这里的发现证实了E. pyrifoliae具有这些特征。首先，在50和100 μg/mL的链霉素浓度下都观察到了双相的时间-杀灭曲线。这些浓度分别大约相当于韩国果园中通常使用的剂量的一半和全剂量。值得注意的是，存活的持久细胞比例...

结论

本研究首次证明，导致黑梢病的E. pyrifoliae可以通过形成持久细胞来存活链霉素处理。这些持久细胞表现出双相的杀灭动态和对多种抗生素及氧化应激的增强耐受性，同时相对于正常细胞表现出较低的毒力。转录组分析进一步揭示了毒素-抗毒素系统、如rpoS等应激调节因子以及氧化还原平衡的协调激活...

CRediT作者贡献声明

林赫：撰写——原始草稿、软件使用、实验研究、数据分析。俊明宇：撰写——审阅与编辑、方法学设计、资金获取、概念构思

数据和材料的可用性

本研究的RNA-seq原始数据已存入Sequence Read Archive（SRA）数据库，访问号为PRJNA1337334（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1337334）。

生成式AI使用声明

作者声明，人工智能工具（例如ChatGPT）仅用于语言润色和语法改进。所有实验设计、数据采集、数据分析和解释均由作者完成。

资金来源

本项目得到了韩国农村发展行政机构的Agenda计划（RS-2021-RD009496）的资助

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。