细菌的多维分析揭示了在处理以硝酸盐为主的水产养殖废水的混合营养反硝化系统中填充比的设置情况

本研究开发基于FeS2和聚己内酯（PCL）的分置混合异养反硝化系统（PPMD）处理循环水产养殖废水，探究FeS2与PCL体积比（V_F:PCL）对脱氮性能的影响。结果表明V_F:PCL=5:1时总无机氮去除效率达88.9±5.3%。网络分析显示PCL层菌群模块化程度更高且正互作更强，共生关系维持系统高效性。关键菌属（假单胞菌、玫瑰单胞菌、硫杆菌、硫氧化菌）在FeS2和PCL层分别富集。通过多维生态网络分析揭示了菌群互作与代谢途径关联，阐明最佳V_F:PCL的调控机制。

　　

Xihui Guo|Yujie Mao|Lingwei Kong|Guanghui Guo|Shiyang Zhang|Qinglong Wang|Yuhu Nie|Yufan Xie|Zhi Wang

武汉理工大学土木工程与建筑学院，中国武汉430070

摘要

在循环水产养殖系统（RAS）中，硝酸盐的过度积累会对养殖生物和周围的废水接收环境造成严重的负面影响。本研究基于黄铁矿（FeS₂）和聚己内酯（PCL），开发了一种基于黄铁矿+PCL的分裂混合营养反硝化（PPMD）系统，用于处理来自RAS的模拟硝酸盐主导的废水。研究的重点是探讨黄铁矿与PCL的体积比（V_F:P）对混合营养系统性能的影响。结果表明，在V_F:P = 5:1时，总无机氮去除效率最高（88.9?±?5.3%）。网络分析显示，PPMD系统中黄铁矿层的细菌群落特征比PCL层更复杂，后者表现出更高的细菌模块性和更强的细菌正相关关系。PCL层中有机物降解与异养细菌之间的共生关系有助于维持PPMD系统的优异性能。研究发现四种细菌属（Pseudomonas、Roseomonas、Thiobacillus和Thiomonas）是不同填充层中的关键物种。本研究应用多维分析来阐明PPMD系统中的细菌生态网络和代谢途径，旨在确定最佳V_F:P值，为实际应用提供参考。

引言

与传统养殖方法相比，循环水产养殖系统（RAS）在土地和水资源利用方面具有更高的效率，这种效率的提升使得RAS在水产养殖行业中得到了广泛应用（Preena等人，2021年）。在RAS的水处理方面，大多数研究集中在氨氮（NH₄⁺-N）或亚硝酸盐氮（NO₂^--N）的去除上，但这往往导致水中硝酸盐氮（NO₃^--N）的积累（Chen等人，2022b年）。为了降低RAS中的NO₃^--N水平，通常采用换水方法；然而，这种做法会导致大量的水资源消耗，并增加环境中的NO₃^--N污染（Gao等人，2020年）。此外，RAS废水大多具有较低的碳氮比（C/N）。如果采用传统的生物反硝化工艺进行处理，通常需要补充外部碳源（Gao等人，2020年；Qi等人，2020年）。

最近，混合营养反硝化系统结合了自养和异养反硝化的优点，在处理低C/N比废水方面表现出更好的效果，特别是在降低对外部有机碳需求的同时实现了更高的氮去除效率（Guo等人，2024a年；Tong等人，2017年）。在各种电子供体中，聚己内酯（PCL）因其较高的碳释放率而被广泛使用（Fang等人，2020年）。此外，基于黄铁矿的自养反硝化（PAD）系统因其低成本和产生的污泥量少而受到关注（Chen等人，2023年）。因此，结合PCL和黄铁矿的分裂混合营养反硝化系统得到了广泛研究，显示出优异的处理效率（Zhu等人，2024年）。例如，Yuan等人（2023年）和Guo等人（2024a年）发现，使用分裂混合营养（黄铁矿 + PCL）系统（PPMD）可以实现超过98%的平均NO₃^--N去除效率（NRE）。此外，Zhu等人（2024年）报告称，混合营养反硝化系统能够有效抵抗抗生素带来的外部环境干扰，保持高效稳定的处理性能。

此外，PPMD系统的处理成本和性能可能会随着黄铁矿或PCL填料体积的不同而变化。一般来说，由于异养反硝化的效率高，增加混合营养系统中的固体碳源量可以提高反硝化效率；然而，这可能导致有机碳源的过度消耗或浪费（Qi等人，2020年）。此外，Zhou等人（2022b年）指出，在结合黄铁矿和聚3-羟基丁酸-羟基戊酸（PHBV）的构建混合营养反硝化系统中，当黄铁矿与PHBV的质量比为2:1时，反硝化效率最高（99.7%），在1:1–2:1的范围内。基于这些发现，我们认为增加PPMD系统中的PCL装载量不仅会增加填充成本，也无法进一步提高反硝化效率。因此，我们假设存在一个最佳的黄铁矿与PCL的体积比（V_F:P），以在系统的PCL填充量和反硝化能力之间达到最佳平衡，从而以最低的填充成本实现最高的氮去除效率。

值得注意的是，黄铁矿和PCL的共存在PPMD系统中创造了复杂的电子供体环境，某些功能细菌在这些特定条件下可能具有相对的优势。例如，Yuan等人（2023年）报告称，Thiobacillus和Syntrophomonas分别在黄铁矿层和PCL层的生物膜中相对丰富。然而，遗憾的是，迄今为止的大多数研究仅对PPMD系统中的主要功能细菌进行了分类，忽略了不同填料表面细菌群落结构的全面分析以及低丰度关键物种的鉴定（Guo等人，2024a年；Yuan等人，2023年；Zhu等人，2024年）。此外，根据它们的营养模式，细菌可以在不同的填料表面上聚集形成特定的生态位，从而形成专门的“模块”，即功能性的细菌组合（例如，用于反硝化或有机物降解）（Zou等人，2024年）。彻底研究每个细菌模块内的物种组成及其之间的潜在相互作用对于阐明系统的处理效率和稳定性至关重要。此外，基于黄铁矿的分裂混合营养反硝化系统中黄铁矿和有机碳源的共存可能促进完整的硫/铁循环（Zhou等人，2022a年）。这些循环过程与系统中的反硝化和碳代谢密切相关，可能是分裂混合营养反硝化系统功能的关键机制。然而，具体的耦合和调控机制，特别是耦合如何响应填料比例的变化，目前仍不清楚。监测硫酸盐和溶解铁浓度的变化，并结合功能细菌/基因的分析，将有助于阐明系统中碳、氮、硫和铁代谢之间的相互作用机制。

为了解决上述不确定性，本研究将黄铁矿与PCL结合，构建了一个PPMD系统。主要目标是：1）研究V_F:P对系统性能的影响，并确定最佳运行条件；2）探讨V_F:P如何影响细菌群落组成和功能基因谱型，并通过分子生态网络（MEN）分析细菌与功能基因之间的可能相互作用；3）进行模块分析，并根据细菌MEN识别与代谢过程相关的关键细菌/功能基因。通过上述分析，本研究试图为未来PPMD系统中优化V_F:P的设置奠定基础。

反应器构建

反应器是一个圆柱形有机玻璃容器，内径为50毫米，高度为550毫米（图S1）。模拟的RAS废水通过底部入口进入反应器，依次流经砾石支撑层、填充有黄铁矿的部分、填充有PCL的部分，最后是未填充的区域。砾石支撑层（高度：100毫米）填充了粒径为2–4毫米的砾石，以支撑填充材料并促进水流均匀

氮的变化

本研究评估了六个不同的黄铁矿与PCL的体积比（V_F:P值（1:0、5:1、2:1、1:1、1:2和1:5；分别称为处理组R1至R6）对反硝化效率的影响（图S2(a)和(b)）。R2-R6组的NRE显著高于R1组（图1(a)）。天然黄铁矿具有稳定的电子结构和低溶解度，这限制了PAD系统的反硝化能力（Chen等人，2023年）。在本研究中，R2-R6组在黄铁矿中添加了PCL。多种电子供体的存在

结论

与单独的PAD系统相比，PPMD系统实现了更高的反硝化效率，并有效减少了NO₂^--N或SO₄^2-的产生。在V_F:P为5:1时，PPMD系统的反硝化效率达到88.9?±?5.3%，且PCL填充比例较低。细菌群落分析显示，变形菌门（Proteobacteria）是主要的细菌门类，关键的功能菌属在黄铁矿表面（Thiobacillus和Rhodanobacter）和PCL表面（Actinomadura）得到选择性富集

CRediT作者贡献声明

Yujie Mao： 数据分析、数据管理。Lingwei Kong： 文章撰写——审稿与编辑、资金获取。Guanghui Guo： 监督、概念构思。Shiyang Zhang： 文章撰写——审稿与编辑、监督。Qinglong Wang： 实验研究、数据分析。Yuhu Nie： 数据分析、数据管理。Yufan Xie： 数据分析、数据管理。Zhi Wang： 文章撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。Xihui Guo： 初始草稿撰写、实验研究、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：U23A2059；32471696）和杭州市重点科研计划项目（编号：2024SZD1B25）的财政支持。