《Scientia Horticulturae》：Lignin’s Indispensable role in orchestrating seed stone formation: Insights from jujuba, peach and pear with future prospective on pitless fruits
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这篇综述系统阐述了复杂芳香聚合物木质素在核果（如枣、桃、梨）硬核形成中的核心作用。文章聚焦于木质素的组成、生物合成通路（涉及PAL、C4H、LAC、PRX等一系列酶）、以及由转录因子（如MYB24、bZIP48）、植物激素（生长素、赤霉素）和钙离子（Ca2+）信号构成的精密调控网络。作者深入探讨了通过基因工程（如CRISPR/Cas9）精准调控木质素沉积以实现无核（pitless）果实培育的策略，为改良核果品质、降低加工成本提供了前沿的分子视角和未来展望。
木质素的组成、结构及在植物细胞中的生物合成
木质素是一种对维持细胞壁结构完整性至关重要的生物聚合物，为茎秆提供强度和刚性。它由三种木质素单体——对香豆醇（p-coumaryl alcohol）、松柏醇（coniferyl alcohol）和芥子醇（sinapyl alcohol）——通过氧化聚合形成，这些单体通常通过苯丙烷/酪氨酸代谢途径产生。木质素的生物合成非常复杂，可分为三个步骤：(a) 木质素单体的生物合成，(b) 运输，以及 (c) 木质素单体的聚合。单体在植物细胞质中合成，随后通过糖基化或ABC转运蛋白等方式运输到细胞壁，最后在过氧化物酶（POD）和漆酶（LAC）的催化下聚合。
木质素生物合成基因的表观遗传调控
表观遗传调控在控制植物发育过程中木质素生物合成和聚合基因的表达方面扮演重要角色。DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑可以在不改变底层DNA序列的情况下，通过改变染色质可及性来激活或抑制木质素相关基因。在桉树中，木质素生物合成基因（包括CAD2和CAD3）富含H3K4me3激活标记，这促进了它们在次生细胞壁形成期间的高表达。环境因素可以影响DNA甲基化，进而调节木质素生物合成基因的表达，将外部信号与次生细胞壁形成的表观遗传调控联系起来。
木质素生物合成的翻译后调控
除了表观遗传和转录控制，木质素生物合成还通过动态的蛋白质修饰在翻译后水平受到严格调控，从而微调酶活性、蛋白质稳定性和信号输出。翻译后蛋白质修饰，包括泛素化、磷酸化和乙酰化，使得苯丙烷途径中的关键酶和转录因子能够被快速可逆地调节。在拟南芥中，钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）使PAL同工酶磷酸化，导致酶活性降低并减少流向木质素生物合成的代谢通量。在火炬松中，PtMAPK6磷酸化PtMYB4，从而抑制其反式激活细胞壁生物合成基因的能力，防止在分裂和扩张的细胞中过早沉积木质素。在毛竹中，PeKFB9作为SCF E3泛素连接酶复合物的一部分，靶向木质素生物合成酶PePAL10和转录因子PebZIP28667进行泛素化降解，从而在酶活性和转录水平双重抑制木质素积累。
果实内果皮的发育
核果分为三层：外果皮（最外层，果皮）、中果皮（中间层，柔软可食用）和内果皮（最内层）直接包裹种子。在枣、桃、李等核果中，内果皮坚硬且不可食用。内果皮从子房内层分离出来，各层紧密附着在种子上。内果皮硬化是核果的一个特征，始于果实趋向成熟时。次生细胞壁的形成及其木质化导致了内果皮的硬化。次生细胞壁由木质素、半纤维素、纤维素和少量果胶的不同层组成。
果实内果皮木质化的时间进程
在不同核果中，内果皮木质化在开花后的不同时期开始。最近的关于木质化时间的研究表明，内果皮的形成是一个协调良好的机制，在2-3周内完成。核果经历4个不同的阶段，从发育到成熟。通常，核的硬化（木质化）始于果实从I期生长转向II期期间，这导致果实生长减缓，呈现双S形生长曲线，并导致中果皮生长暂停。内果皮木质化期间中果皮生长暂停，可能是由于木质化对碳和能量的需求增加，也可能是持续的胚胎生长所致。在桃果实中，木质素积累在开花后37天（DAB）开始，在59 DAB完成，此时内果皮变得足够坚硬，无法用刀切割。在枣果实中，木质素积累在开花后25天（DAF）从内果皮基部开始。在梨果肉中，基于生物正交点击化学的体内成像显示，木质化在盛花后10天（DAFB）早期就开始了。
内果皮和石细胞的遗传背景
木质化
植物研究技术的进步使得研究内果皮木质化的遗传背景成为可能。最近的证据表明，枣果实内果皮的木质化受一个先前未被识别的调控模块控制，该模块由转录因子ZjbZIP33及其下游靶标ZjPRX1（一种对木质素聚合至关重要的III类过氧化物酶）组成。在桃中，参与拟南芥角果开裂的大多数基因的同源物也参与了内果皮的发育。桃的SHP和STK基因同源物在授粉后不久在内果皮中上调表达。在库尔勒香梨中，转录组学研究揭示了石细胞形成的遗传背景，表明四个木质素生物合成基因（PAL1、C4H、HCT和CCR1-L）在开花后20天到80天持续表达。咖啡酰莽草酸酯酶（CSE）是拟南芥中与木质素合成有关的关键酶。在桃果实中，PpCSE基因在果实发育后期（50和55 DAF）在内果皮组织中的表达量是中果皮组织的80.73和72.75倍。在杏中，对软内果皮和硬内果皮品种的比较转录组学和形态学研究揭示了木质素生物合成基因的差异表达。
许多上游遗传元件也参与调控木质素生物合成基因。转录因子在调节木质素形成中至关重要。在桃中，与拟南芥角果开裂相关的转录因子SHP、STK和IND的同源物在内果皮中上调，其表达在29 DAF时达到最大。在拟南芥中，果实开裂由组织特异性方式作用的激素响应性转录模块控制，其中INDEHISCENT (IND) 转录因子通过激活GA3OX1促进局部赤霉素（GA）积累，导致DELLA不稳定并激活分离层中的ALCATRAZ (ALC)。值得注意的是，类似的调控元件在梨石细胞木质化过程中起作用，其中ARF转录因子和GA生物合成基因（如GA3OX1）调节内果皮中的木质素沉积和次生细胞壁加厚。在梨果实中，新的转录因子MYB24在木质素和纤维素生物合成基因的转录激活中起重要作用。PbrMYB24直接与另一个转录因子PbrNST1和PbrMYB169相互作用，并激活包括4CL1和CCoAOMT1在内的木质素生物合成基因的表达。PbrMYB24转录因子的过表达显著增加了梨果实中的石细胞。
激素和microRNA介导的内果皮木质化及石细胞发育调控
木质化通过植物激素对木质素生物合成酶及其表达调控转录因子的协同效应进行动态控制。生长素信号在梨石细胞分化过程中对木质化的调控至关重要。在该调控框架内，ARF及其下游靶标是石细胞木质化的关键调节因子。全基因组表征揭示了梨中有31个ARF基因，其中PbARF19（木质化抑制因子PtrARF2.1的同源物）在木质化组织和发育早期阶段显著表达。功能分析表明，PbARF19的过表达显著抑制木质素生物合成基因的表达，导致梨愈伤组织和果实以及拟南芥中木质素积累减少。此外，PbARF19活性升高会抑制次生细胞壁加厚，证实其作为木质化负调节因子的功能。外源施用萘乙酸（NAA，一种合成生长素）可减少梨果实石细胞的木质化。外源施用NAA会上调生长素响应转录因子PbrARF13，从而下调PbrNSC的表达。NSC是一种NAC石细胞促进因子，可与木质素生物合成基因的启动子结合，在其转录中起重要作用。通过外源施用合成生长素下调PbrNSC转录因子，可降低石细胞中的木质素含量。同样，赤霉素（GAs）已被证明会影响内果皮发育和石细胞木质化，在果实成熟过程中调节木质素沉积方面起关键作用。在杏的软、薄内果皮品种中，转录组数据显示GA3OX1下调，表明内果皮中GA生物合成或信号转导减少。这种下调可能导致次生细胞壁加厚和木质素沉积受限。外源施用GA?通过抑制PuMYB91和PuERF023转录模块来抑制石细胞形成，从而减少木质素生物合成基因PuPRX73的激活，导致木质素积累减少。相反，由PbGA3OX4介导的内源性GA产生通过增加生物活性GA水平促进木质素沉积和石细胞发育。在枣果实中，外源施用IAA和GA?促进了内果皮中的木质素沉积，并上调了有核品种‘金丝’中ZjbZIP33和ZjPRX1的表达。最近在梨果实中的研究表明，钙离子（Ca2+）信号通过抑制PuNAC21和PuDof2.5转录调控模块的木质素生物合成来减少石细胞形成。Ca2+处理抑制PuNAC21，导致木质素生物合成基因PuPRX42-like和PuCCoAOMT1的激活减少，从而降低木质素沉积和石细胞积累。microRNAs (miRNAs) 和长链非编码RNAs (lncRNAs) 也参与调控木质素生物合成。miRNAs是葡萄浆果核硬化阶段的关键调节因子，作用于赤霉素信号和木质素生物合成的交汇点。高通量测序发现了核硬化特异性和发育调控的miRNAs，它们靶向参与次生细胞壁形成、激素信号和胚胎发育的基因。重要的是，GA处理会诱导VvmiR31-3p和VvmiR8-5p，它们直接抑制核心木质素生物合成酶VvCCoAOMT和VvDCAF1，从而减少木质素沉积、抑制核硬化和胚胎发育。激素和microRNAs共同调节甜樱桃从发育到成熟的转变，通过调控内果皮木质化和色素生物合成。miR156靶向的PavSPL转录因子在成熟前和成熟期间表达，并显示出与木质化时间和果实成熟度差异相关的品种特异性表达模式。生长素相关处理改变了内果皮木质化和花青素积累，同时伴随PavSPL表达减少，而共表达分析将PavSPLs与木质素和花青素生物合成途径联系起来。在毛白杨中，有36个属于17个不同microRNA家族的microRNAs参与调控木质素生物合成基因。一些microRNAs在抑制主要木质素生物合成基因中起重要作用。miR397a抑制编码主要木质素合成酶的漆酶基因。在中国梨中，miR397a的过表达导致三个漆酶基因同时受到抑制，从而降低了木质素含量。
木质素基因在果实木质化中的瞬时表达
由于核果果树的幼年期长，木质素生物合成基因的稳定转化仍需进行，因为需要很长时间来检查木质素生物合成基因对果实内果皮的影响。然而，不同木质素合成基因的瞬时表达已经完成，并且研究了它们对内果皮组织木质素组成的影响。咖啡酰莽草酸酯酶（CSE）在梨果实木质素生物合成中的作用已被研究。PbCSE1的瞬时过表达导致梨果实中木质素含量增加，而在拟南芥中，PbCSE1的稳定过表达导致茎中木质素积累比野生型拟南芥更多。草莓果实中查尔酮合酶（CHS）基因的瞬时沉默诱导了FaPOD27的表达水平，导致果实中木质素含量增加。已鉴定出多种可促进木质素合成基因表达的转录因子。在枇杷果实中，MYB转录因子EjODO1参与枇杷果实的木质化。EjODO1的瞬时过表达通过反式激活木质素合成基因Ej4CL1的启动子，在果实发育早期触发了木质素积累。已对脱木质素基因的瞬时表达进行了研究，并观察到木质素含量减少。梨果实中PbrmiR397a的瞬时表达降低了木质素含量以及石细胞数量。PbrmiR397a在烟草中的稳定过表达通过抑制对木质素聚合重要的漆酶基因的表达，降低了木质素含量。PbrARF13是木质素石细胞发育的另一个负调控因子，在梨果实开花后35天（DAF）瞬时过表达降低了梨果实中的木质素含量。在开花后39天的梨果实中瞬时过表达PbrSAUR52表明它增强了石细胞形成和木质素积累，而PbrSAUR13则抑制这些过程，突出了它们在果实发育过程中调节石细胞木质化的相反作用。
缩短核果长幼年期以开发无核果实
果树的长幼年期是利用基因编辑技术的一大障碍，因为在使用CRISPR/Cas9和RNA干扰技术编辑木质素生物合成途径基因后，需要很长时间才能看到结果。因此，有必要缩短核果的长幼年期。在李子的研究中，研究人员通过过表达FLOWERING LOCUS T基因缩短了李子的长幼年期。结果，李子树在移入土壤后1-10个月内开始开花和结果。FLOWERING LOCUS T基因在整合开花信号中起重要作用。PaFT基因在拟南芥中的过表达导致种子播种后18天内开始开花，而野生型植株在31天后才开始开花。在苹果中，两个FLOWERING LOCUS T基因的表达模式在不同组织中表现出不同的表达行为。MdFT1主要在成年期的结果枝顶芽中表达，而MdFT2主要在花芽和幼果中表达。MdFT1的过表达赋予苹果提早开花的特性，并改变了其他内源基因（如MdMADS12）的表达。这表明MdFT1通过改变开花调控基因的表达来促进开花。这些研究证明，通过利用FLOWERING LOCUS T基因，也可以缩短核果的长幼年期。一旦长幼年期缩短，就可以在短时间内研究内果皮的表型。
无核果实开发的最新进展
无核果实的开发是一个引人入胜的研究和创新领域，特别是对于寻求便利的消费者和旨在减少浪费的生产者。通过消除果核，这些果实提供了更高的便利性、减少的浪费以及潜在的新颖烹饪应用。通过将传统育种方法与生物技术相结合，美国农业部农业研究局的科学家们通过开发无核李子推进了果树育种。无核果实的想法并不新鲜，早在20世纪初，多产的园艺学家卢瑟·伯班克就将部分无核的野生李子与加州法国李品种杂交。这些杂交产生了几乎完全无核但仍含有种子的商业品质果实。目前，美国农业部农业研究局的科学家利用伯班克的无核品种启动了新的育种计划。研究人员将伯班克的无核品种与早花性状进行了工程改造，希望以此加速育种计划以开发无核李子。无核李子和有核李子的木质素生物合成基因表达相似，这表明无核李子的内果皮组织中表达了一些其他基因，抑制了木质素的积累。无核李子内果皮中的细胞数量显示减少，内果皮组织中细胞的减少导致了无核果实的发育。在无籽苹果品种中，存在核心组织，降低了无籽苹果的吸引力。MADS14和MADS15是心皮基因，但它们在苹果核心组织中的表达导致木质素积累。通过使用RNAi技术下调MADS14和MADS15，可以开发出无核心苹果。因此，通过下调核心木质化基因，未来有希望开发出无核品种。
结论与未来展望
食用核果而不必担心果核，对消费者来说是非常理想的，这可能会增加水果消费和种植者的利润，同时降低加工成本。开发无核核果需要靶向坚硬的木质内果皮，这主要是通过结构基因（PAL、C4H、C3H、CCoAOMT、CAD、PRX1）和转录因子（MYB24、NST1、bZIP3、bZIP48）介导的木质素聚合形成的。激素信号（生长素、赤霉素、Ca2+）和microRNAs（例如miR397a、miR31-3p、miR8-5p）调节这些基因，微调木质素沉积和次生细胞壁加厚。木质素途径基因和转录因子的鉴定为阻断核发育的下一步铺平了道路。通过CRISPR/Cas9和RNA干扰对木质素生物合成基因进行敲除或敲低，可以导致无核核果的开发。到目前为止，尚未通过基因工程技术实现开发无核果实的实际成功，因为转化植物需要较长的营养生长期。然而，CRISPR/Cas9技术已应用于其他作物。在甘蔗中，使用CRISPR/Cas9下调LIM结构域转录因子（LIM）降低了木质素生物合成基因（包括SoPAL、SoC4H和SoCAD）的表达水平。甘蔗的编辑品系降低了木质素含量并具有较高的紫丁香基/愈创木基（S/G）比率。在杂交杨树（银白杨 × 腺毛杨）的另一项研究中，使用CRISPR/Cas9基因靶向敲除咖啡酰莽草酸酯酶基因导致木质素减少29.1%。这些证据表明，利用CRISPR/Cas9技术敲低木质素生物合成基因，可能在不久的将来导致无核果实的开发。在苹果和梨植株中敲除编码开花抑制蛋白的TFL1基因后，基因编辑的品系表现出提早开花和更短的营养生长期。早花FLOWERING LOCUS T基因的过表达减少了许多果树的营养生长，包括李子、苹果和鳄梨。因此，未来首先开发早花核果，其次敲低或敲除木质素生物合成基因，可能会在短期内导致无核核果的开发。木质素单体在细胞壁中的聚合对于硬内果皮的发育是必要的，许多转录因子和木质素单体生物合成基因已被研究，通过基因编辑技术下调这些转录因子和基因将产生内果皮薄的核果，这是由于细胞壁中木质素单体的聚合减少所致。除了木质素生物合成基因，还有一些证据表明，花同源异型蛋白（Pistillata）的表达通过显示苹果核心中木质素较少而改变了葡萄和苹果果实的形状。因此，未来通过在果实中过表达花同源异型蛋白（Pistillata）有可能开发出无核果实。在内果皮发育阶段，在内果皮特异性组织中时空表达花同源异型蛋白（Pistillata）的新思路可能会引领无核果实的开发。
