Complex I依赖性线粒体膜电位维持：区分胞内致病菌毒力的关键生物能量检查点

《Infection and Immunity》：Complex I preserves mitochondrial polarization during infection of human macrophages by secretion-competent bacteria

本文通过研究嗜肺军团菌与鼠伤寒沙门氏菌感染人类巨噬细胞的早期过程，揭示了线粒体电子传递链（ETC）在维持线粒体膜电位（Δψm）中的独特作用模式。研究发现，尽管两种病原菌均通过其分泌系统（T4SS/T3SS）降低宿主细胞的呼吸作用，但它们采用了不同的策略来维持Δψm。特别是，复合物I（Complex I）的活性成为区分具有分泌能力的致病菌与其缺陷突变体的关键生物能量检查点。这项研究为理解胞内病原体与宿主线粒体之间的相互作用提供了新的见解。

　　

引言：线粒体是宿主-病原体相互作用的中心

胞内细菌病原体通过重编程宿主细胞代谢来获取营养并进行复制。巨噬细胞作为哨兵免疫细胞，是此类细菌的常见靶标。嗜肺军团菌和鼠伤寒沙门氏菌是两种代表性的胞内病原体，它们分别利用IV型分泌系统（T4SS）和III型分泌系统（T3SS）向宿主细胞注入效应蛋白，操纵包括线粒体功能在内的多种宿主过程。线粒体作为能量产生和炎症反应、细胞死亡等过程的核心细胞器，是病原体作用的关键目标。以往研究表明，这两种病原体在感染早期都能降低宿主细胞的氧化磷酸化（OxPhos）水平，但同时通过不同机制维持线粒体膜电位（Δψ_m），从而延缓宿主细胞死亡，保护其复制生态位。然而，线粒体电子传递链（ETC）中各个复合物在感染期间如何具体参与维持Δψ_m，仍不清楚。本研究旨在通过系统性的方法，揭示在人源巨噬细胞感染模型中，各ETC复合物在维持Δψ_m中的具体贡献。

结果与讨论

1. 仅有具备分泌能力的细菌可降低人巨噬细胞线粒体呼吸

为评估感染如何影响线粒体呼吸及其对细菌分泌系统的依赖性，研究用人单核细胞源性巨噬细胞（hMDMs）分别感染了嗜肺军团菌野生型（WT）及其T4SS缺陷突变体（ΔdotA），以及鼠伤寒沙门氏菌WT及其多种T3SS缺陷突变体。在感染后5小时（hpi）——此时细菌尚未开始复制——通过Seahorse技术测量氧消耗率（OCR）。结果显示，与未感染细胞相比，感染嗜肺军团菌-WT的hMDMs基础OCR显著下降，而ΔdotA突变体并未降低OCR，甚至高于未感染细胞，表明早期的OxPhos下降需要T4SS效应蛋白。同样，鼠伤寒沙门氏菌-WT也降低了基础OCR，这种降低依赖于SPI-1 T3SS（由ΔprgH突变体表型证实），而不依赖于SPI-2 T3SS。此外，感染WT菌株的细胞对FCCP（一种解偶联剂）的反应也减弱，表明其最大呼吸能力和储备呼吸能力均下降。这些结果共同证明，两种不同的胞内细菌通过其分泌系统（嗜肺军团菌的T4SS和沙门氏菌的SPI-1 T3SS），在感染早期协同性地显著降低了人原代巨噬细胞的线粒体呼吸。

2. 尽管线粒体呼吸降低，感染的巨噬细胞仍维持线粒体膜电位

为了探究OCR的降低是否伴随Δψ_m的丧失，研究使用TMRM染料（其荧光强度与Δψ_m成正比）在单细胞水平进行量化。结果显示，在感染后5小时，无论是感染嗜肺军团菌-WT、ΔdotA，还是感染鼠伤寒沙门氏菌-WT、ΔprgH/ΔssaV双突变体，巨噬细胞的Δψ_m均维持在未感染对照组的同等高水平。这表明，尽管呼吸作用因细菌分泌系统而显著降低，Δψ_m在感染早期得以保存。研究还通过CellROX染料检测了线粒体活性氧（mROS）的产生，发现了病原特异性的模式：嗜肺军团菌-WT感染增加了mROS产生，而鼠伤寒沙门氏菌-WT感染则未引起类似的增加。这些结果表明，两种病原体的毒力系统在感染早期实现了呼吸流与线粒体极化的解耦，同时引发了不同的mROS输出。m，同时引发病原特异性的ROS输出。(A) 感染后5小时TMRM（Δψ_m）信号的代表性图像。(B) 单细胞TMRM水平的量化。(C) CellROX（mROS）信号的代表性图像。(D) 单细胞mROS水平的量化。">

3. 线粒体F_OF₁-ATPase在两种细菌感染中的运作模式不同

先前工作表明，嗜肺军团菌通过其T4SS效应蛋白LpSpl，迫使线粒体F_OF₁-ATPase以反向模式（水解ATP）运行，从而维持Δψ_m。为探究F_OF₁-ATPase和腺嘌呤核苷酸转运体（ANT）在感染期间的运作方向，研究在活细胞成像中加入特异性抑制剂DCCD（抑制F_O质子通道）和Bongkrekic Acid（BA，抑制ANT）。在嗜肺军团菌-WT感染期间加入DCCD，导致TMRM信号在60分钟内下降25%，证实了F_OF₁-ATPase以反向模式运作。而在未感染或ΔdotA感染的细胞中，DCCD引起轻微的膜超极化，符合其正向（合成ATP）模式。相比之下，在鼠伤寒沙门氏菌-WT或双突变体感染期间加入DCCD，细胞行为与未感染细胞相似，表明沙门氏菌并不主要依赖F_OF₁-ATPase的反向活性来维持Δψ_m。单独加入BA仅引起所有条件下Δψ_m的轻微且相似的下降，而当BA与DCCD共同加入时，嗜肺军团菌-WT感染细胞的TMRM下降曲线与单独加入DCCD时无差异，表明在感染后5小时，ANT仍保持正向模式（将基质ATP输出至胞质）。综上所述，嗜肺军团菌在感染早期诱导线粒体ATP合酶反向运行以维持膜电位，但ANT仍保持正向模式；而鼠伤寒沙门氏菌则在不显著逆转ATP合酶活性的情况下维持线粒体极化。OF₁-ATPase的运作模式在嗜肺军团菌和鼠伤寒沙门氏菌感染中存在差异。(A) 线粒体F_OF₁-ATPase和ANT在正向与反向模式下的运作示意图。(B) 感染后5小时加入DCCD后Δψ_m（TMRM）的变化。(C) 鼠伤寒沙门氏菌感染下加入DCCD的结果。(D) 加入BA的结果。(E) 同时加入BA和DCCD的结果。">

4. Complex I驱动的Δψ_m维持可区分有分泌能力的致病菌与其缺陷型

为探究呼吸链中哪些复合物在感染期间维持Δψ_m，研究在感染后5小时向hMDMs中加入各ETC复合物的特异性抑制剂，并监测单细胞TMRM荧光。抑制复合物I（加入鱼藤酮）导致嗜肺军团菌-WT和鼠伤寒沙门氏菌-WT感染的细胞Δψ_m显著下降约35%，而未感染细胞仅下降15%，分泌缺陷突变体（ΔdotA, ΔprgH/ΔssaV）的下降幅度更小。这表明复合物I的活性对于致病性WT菌株维持Δψ_m至关重要。同一鱼藤酮处理也显著增加了感染巨噬细胞的mROS产生。抑制复合物II（加入TTFA）在所有感染条件下均降低了Δψ_m，但对未感染细胞影响甚微，提示复合物II仅在细菌感染（无论毒力强弱）扰动代谢流时才支持Δψ_m。抑制复合物III（抗霉素A）或复合物IV（氰化钠）则导致所有组别的Δψ_m崩溃，表明这两个下游质子泵在所有感染状态下都是维持Δψ_m所必需的。这些模式表明，细菌分泌系统的存在引导电子流通过复合物I以维持Δψ_m并可能产生mROS。因此，复合物I的活性成为一个生物能量检查点，用以区分有分泌能力的胞内致病菌与其分泌缺陷型，而复合物III和IV则是普遍必需的。OF₁-ATPase示意图，标明了抑制剂靶点。(B) 感染后5小时加入鱼藤酮（复合物I抑制剂）后Δψ_m的变化。(C) 相同处理下mROS的测量。(D) 加入TTFA（复合物II抑制剂）评估复合物II贡献。(E) 加入抗霉素A（复合物III抑制剂）。(F) 加入氰化钠（复合物IV抑制剂）。">

工作模型

基于以上发现，研究提出了一个解释两种病原体特异性ETC调控的工作模型。对于嗜肺军团菌，其T4SS效应蛋白（如MitF）在感染早期通过片段化线粒体网络来抑制OxPhos，同时另一效应蛋白（LpSpl）参与驱动F_OF₁-ATPase进入反向（水解）模式，泵出质子以维持Δψ_m。由于这种反向活性有效维持了较高的Δψ_m，ANT得以保持正向模式，可能由效应蛋白LncP稳定，从而避免胞质ATP耗竭。所有ETC复合物（I–IV）在此条件下都有助于维持Δψ_m，但复合物I仅在WT感染时是必需的。对于鼠伤寒沙门氏菌，其SPI-1 T3SS效应蛋白（如SopE2）降低线粒体呼吸，而SPI-2效应蛋白（如SipA）通过促进线粒体伸长来维持Δψ_m，且不逆转F_OF₁-ATPase。致病菌主要依赖流经所有ETC复合物（特别是复合物I）的电子流，而分泌缺陷突变体则无法启动这种复合物I驱动的回路，其表型类似于非致病的嗜肺军团菌ΔdotA突变体。总之，这些发现揭示了病原体特异性的ETC调控层级：复合物I的活性界定了由毒力胞内细菌引起的感染，而逆转ATP合酶活性以维持Δψ_m的能力，则区分了巨噬细胞被嗜肺军团菌感染与被鼠伤寒沙门氏菌感染时的ETC功能模式。m的病原体特异性ETC调控工作模型。(A) 嗜肺军团菌：T4SS效应蛋白在感染早期抑制OxPhos，并通过启动F_OF₁-ATPase的反向模式来维持Δψ_m。(B) 鼠伤寒沙门氏菌：T3SS效应蛋白降低呼吸并维持Δψ_m，但不诱导F_OF₁-ATPase的反向模式。">