《Journal of Virology》：The ORF6 accessory protein contributes to SARS-CoV-2 virulence and pathogenicity in the naturally susceptible feline model of infection
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本研究表明，SARS-CoV-2 辅助蛋白 ORF6 是病毒的重要毒力决定因子，通过抑制宿主干扰素 (IFN) 和核因子κB (NF-κB) 信号通路，在天然易感猫模型中显著影响病毒的致病力、复制与传播。该研究揭示了 ORF6 蛋白在体内感染动力学和免疫逃逸中的关键作用，为理解新冠病毒 (COVID-19) 的发病机制和开发新型防治策略提供了重要见解。
SARS-CoV-2 ORF6 蛋白的体外功能表征
研究人员通过反向遗传学技术，在具有高度毒力的 SARS-CoV-2 WA1 病毒株 (rWA1) 骨架上，构建了缺失 ORF6 基因的重组病毒 (rWA1ΔORF6)。体外研究表明，尽管两种病毒在多种细胞系 (Vero E6 TMPRSS2、Calu-3 和稳定表达猫 ACE2 受体的猫肺细胞) 中复制动力学相似，但 rWA1ΔORF6 病毒形成的噬斑显著小于 rWA1 病毒，表明其细胞间传播能力减弱。
为了深入探究 ORF6 对宿主先天免疫的抑制作用，研究利用荧光素酶报告基因检测。在 HEK293T 细胞中过表达 ORF6 蛋白，可显著抑制仙台病毒 (SeV) 或多聚肌苷酸-多聚胞苷酸 poly(I:C) 诱导的干扰素-β (IFN-β) 信号通路、SeV 诱导的干扰素调节因子3 (IRF3) 信号通路、肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 诱导的核因子κB (NF-κB) 信号通路的激活。研究进一步检测了 IFN-β 增强子上的两个正调控结构域 (PRDII 和 PRDIII) 的活性，发现 ORF6 同样能够抑制其活化。通过定量聚合酶链反应 (qPCR) 进行的基因表达分析证实，在 ORF6 过表达的细胞中，经 poly(I:C) 刺激后，IFNB1、ISG15和 NFKBIA的信使核糖核酸 (mRNA) 表达水平显著下调。这些结果表明，ORF6 能够拮抗 IFN-β 和 NF-κB 信号通路。
研究进一步在病毒感染背景下验证了 ORF6 的免疫抑制功能。感染了 rWA1ΔORF6 的 HEK293T-hACE2 细胞，在后续接受 SeV 或 TNF-α 刺激时，其 IFN-β 或 NF-κB 报告基因的激活水平显著高于感染了 rWA1 的细胞。这说明，在 rWA1 病毒中删除 ORF6 基因，会削弱病毒抑制宿主先天免疫信号通路的能力。
ORF6 缺失在猫感染模型中的致病性研究
研究采用对 SARS-CoV-2 天然易感的家猫模型，评估了 ORF6 在体内的致病作用。实验设计将猫分为三组，分别接种 rWA1 病毒、rWA1ΔORF6 病毒或模拟接种物。结果显示，接种 rWA1 的猫表现出精神沉郁，并在感染后第2天和第4天出现发热。相比之下，接种 rWA1ΔORF6 的猫仅表现为亚临床感染，无发热症状。尽管两组接种病毒的猫均出现体重维持或下降，而对照组猫体重增加，但 rWA1ΔORF6 组的临床症状明显更轻。
在病毒脱落方面，rWA1ΔORF6 组猫的鼻腔、口腔分泌物及支气管肺泡灌洗液 (BALF) 中的病毒核糖核酸 (RNA) 载量和感染性病毒滴度均显著低于 rWA1 组。这表明 ORF6 的缺失显著降低了病毒在上呼吸道和下呼吸道的复制与排出。
ORF6 对病毒在呼吸道组织中复制与病理的影响
对感染猫的组织分析发现，rWA1ΔORF6 病毒在呼吸道组织中的复制能力有限。在感染后第3天和第5天，rWA1ΔORF6 组猫的鼻甲和气管中的感染性病毒滴度显著低于 rWA1 组。通过原位杂交 (ISH) 技术检测病毒 RNA 定位，结果显示，rWA1 组猫的鼻甲和肺部病毒 RNA 标记的强度和范围显著高于 rWA1ΔORF6 组。在 rWA1ΔORF6 组猫的肺组织中，未检测到病毒 RNA 标记。
组织病理学评估显示，rWA1 感染会引起更严重的肺部病变，包括细支气管坏死、肺泡间隔因单核细胞浸润而增厚、以及肺泡腔内渗出物。而 rWA1ΔORF6 感染仅引起有限的肺部病理变化，其严重程度低于 rWA1 组。这进一步证明 ORF6 蛋白在 SARS-CoV-2 诱导的肺部损伤中扮演关键角色。
ORF6 缺失对宿主转录反应的影响
为了从分子层面理解致病性差异，研究对感染后第3天收集的猫鼻甲组织进行了批量核糖核酸测序 (RNA-seq) 分析。差异表达基因 (DEG) 分析显示，rWA1 感染与 rWA1ΔORF6 感染引发了不同的宿主转录谱。
基因集富集分析 (GSEA) 表明，在 rWA1ΔORF6 感染的猫中，I 型干扰素 (IFN-I) 信号通路和“对 I 型干扰素的反应”通路显著上调，其富集倍数远高于 rWA1 感染组。具体而言，多个干扰素刺激基因 (ISG)，如 RSAD2、IFIT1、IFIT2和 IRF7在 rWA1ΔORF6 感染组中上调表达。通过 qPCR 对部分关键基因的表达验证，证实了 IFIT2在 rWA1 组中表达更高，而 TRIM6在 rWA1ΔORF6 组中表达更高。
这些转录组数据清晰地表明，ORF6 的缺失减弱了病毒抑制宿主先天免疫反应（特别是 I 型干扰素通路）的能力，这可能是导致 rWA1ΔORF6 病毒在体内复制受限和致病力减弱的关键机制。
结论与意义
综上所述，本研究通过体外实验和天然易感的猫感染模型，系统阐明了 SARS-CoV-2 辅助蛋白 ORF6 作为关键毒力决定因子的作用。ORF6 通过抑制宿主的 IFN-β 和 NF-κB 信号通路，实现免疫逃逸，从而增强病毒的细胞间传播、在呼吸道组织中的复制以及致病性。删除 ORF6 基因会导致病毒毒力显著减弱，表现为亚临床感染、病毒复制与脱落减少以及肺部病理损伤减轻。该研究不仅加深了对 SARS-CoV-2 发病机制的理解，也为未来针对病毒免疫逃逸蛋白（如 ORF6）开发新型抗病毒药物或减毒疫苗策略提供了重要的科学依据。
