瓣膜内皮单层裂隙形成及间质基质断裂通过GTP酶信号通路触发钙化病变的形成

《Acta Biomaterialia》：Valve endothelial monolayer fissuring and interstitial matrix fracture triggers calcific lesion formation via GTPase signaling

钙化主动脉瓣疾病（CAVD）早期病理机制不明确，本研究构建了包含VEC和VIC的3D共培养模型，结合活体光学相干和荧光显微镜，动态追踪病变形成。发现内皮层裂解与相邻区域致密聚集体形成是早期生物标志物，伴随VIC和ECM的团块聚集；RhoA激活与纤维化相关，但非钙化必要条件，ROCK抑制剂可有效阻止内皮剥离和纤维化，为靶向治疗提供新思路。

　　

Katherine Driscoll | Santosh Balakrishnan | G Janani | Hrishika Gogineni | Alessandra Good | Andrea Huang | Nichaluk Leartprapun | Steven G Adie | Jonathan Butcher

美国纽约伊萨卡康奈尔大学梅宁生物医学工程学院

摘要

钙化主动脉瓣疾病（CAVD）是一种在老年人群中普遍存在的退行性疾病，症状出现后的生存率很低，但目前尚无有效的药物治疗方法。许多患者在CAVD的晚期才出现症状，此时疾病可能已经不可逆。如果能够实时识别和追踪体内钙化病变的发生过程，将有助于发现疾病的生物标志物，并在更早、更可治疗的阶段找到治疗靶点。在这项研究中，我们建立了一个新的多模式体外CAVD平台，该平台结合了具有谱系追踪能力的血管内皮细胞（VEC）和血管间质细胞（VIC），以及三维模型和实时光学相干显微镜技术，以揭示钙化病变形成过程中VEC、VIC和基质的转变过程。我们发现内皮单层的裂解以及相邻区域密集聚集物的形成是病变发生的关键生物标志物。这一现象与内皮聚集物下方密集的VIC和细胞外基质（ECM）团块的形成相吻合，这也是疾病发病机制的另一个标志。此外，我们还发现纤维化组织的压缩与病变形成有关，但并非必要条件。此外，我们在患病样本中检测到了RhoA的激活。通过抑制RhoA（而非Rac1），可以防止内皮单层的剥离、纤维化重塑以及钙化病变的出现。这项研究建立了一个新的纵向实时成像平台，能够识别CAVD发病过程中的细胞和基质生物学特征，从而评估治疗干预的效果。

意义声明

目前对钙化主动脉瓣疾病（CAVD）病变起源和进展机制的了解有限，这阻碍了针对性治疗的发展。我们构建了一个三维体外CAVD模型，能够生成钙化病变。我们还应用了定量纵向实时成像技术，直接观察介导病变形成和组织重塑的细胞事件，同时减少了实验变异性。研究发现，CAVD的起始阶段表现为瓣膜内皮单层破坏和局部间质基质裂解，这一过程由GTP酶信号通路调控。这些方法有助于确定组织稳态失衡的位置，精确追踪病理转变过程，并揭示CAVD不同阶段的细胞和分子机制。这对于开发针对性药物治疗至关重要。

引言

钙化主动脉瓣疾病（CAVD）是指心脏主动脉瓣逐渐硬化和钙化，如果不进行治疗，最终会导致心力衰竭[1]。早期CAVD的典型表现是主动脉瓣狭窄，75岁以上人群中这一比例超过12%，而1990年至2019年间因CAVD导致的心力衰竭病例增加了90%[2,3]。然而，目前仍没有有效的药物治疗方法[4]。

健康的主动脉瓣由两种主要细胞类型组成：瓣膜内皮细胞（VEC），它们覆盖在瓣膜表面，形成组织与血液之间的屏障；以及瓣膜间质细胞（VIC），负责修复和维护组织的完整性。CAVD的特征是在瓣膜纤维化侧出现钙化结节，进而导致瓣膜增厚和硬化[1],[5],[6],[7],[8]。这些变化降低了瓣膜的开闭能力，影响心脏的正常功能。

尽管CAVD在晚期表现明显，但其早期发生的时空事件仍知之甚少[9,10]。患者通常在出现症状时才就医，此时往往已经发生了不可逆且致命的心肌损伤[11],[12],[13],[14]。如果在瓣膜狭窄发生之前就能识别出钙化病变的关键病理转变阶段，将有助于在疾病可逆阶段识别患者。确定这些早期和中期阶段的分子靶点也有助于改善患者预后。

新的FDA现代化法案2.0允许使用复杂的体外系统来模拟疾病发病机制，从而绕过临床试验中的动物实验要求[15,16]。目前大多数CAVD研究使用的都是二维VIC单培养模型，无法准确反映疾病的多细胞复杂性和三维特性[17],[18],[19]。最近的研究虽然采用了三维生物材料技术，但通常只使用了一种细胞类型（VIC）[17],[20],[21],[22],[23]。CAVD瓣膜样本通常表现出VEC单层和基底膜的破坏，这种破坏仅用VIC细胞无法模拟[6]。

我们的团队开发了一种张力共培养模型，其中VIC细胞与胶原凝胶共同培养，并覆盖有VEC单层[24]。我们之前的研究发现，在VEC+VIC共培养中（而非单独培养VEC或VIC时），骨形成介质能诱导形成较大的三维钙化病变，且两种细胞类型均参与其中[24]。此外，这些VIC-VEC病变独特地再现了人类瓣膜钙化过程中的分子路径空间模式，包括钙化结节中的成骨细胞VIC表达、钙化结节周围区域的软骨形成相关基因表达增加，以及多层结构中的VEC内皮间质转化（EndMT）现象增强[24]。

虽然我们已经能够高效地诱导出时空复杂的多元细胞病变，但由于缺乏实时成像技术，病变形成过程的动态机制仍不清楚。了解导致病变形成的事件链对于识别早期疾病特征和阐明相关机制至关重要。RhoA和Rac1 GTP酶通路在细胞收缩和迁移中起着重要作用[25,26]。特别是RhoA通路可诱导肌成纤维细胞转化和纤维化，这是狭窄瓣膜的特征[27,28]。有证据表明，狭窄瓣膜通常同时存在纤维化和钙化，但两者之间的具体关系尚未明确[28],[29],[30]。先前的研究以及其他研究表明，RhoA和Rac1通路可能参与CAVD的发病机制，但它们如何实时影响VIC和VEC细胞的病变形成过程仍不清楚[31],[32],[33],[34],[35],[36],[37],[38]。

为了解决以往研究中缺乏病变形成时间过程信息的问题，我们使用了之前描述的VEC-VIC共培养模型，该模型模拟了瓣膜的三维结构，并在骨形成条件下产生病变[24]。通过使用GFP标记的VEC细胞和原始VIC细胞，可以追踪VEC的谱系，并区分模型中的VEC、VIC和基质。结合二维和三维纵向成像技术，我们能够跟踪整个培养过程中的变化。通过对样本进行终点染色和免疫荧光成像，可以量化钙离子浓度、EndMT-VEC细胞、α-SMA等RhoA活性相关参数。这种模型和成像技术的结合构成了一个用于研究CAVD过程的纵向实时成像平台。

我们使用明场和宽场荧光显微镜进行整体装片纵向成像，同时使用自制的光学相干显微镜（OCM）和共聚焦显微镜系统进行高分辨率成像，既观察表面也观察样本内部深层结构。这种独特的方法使我们能够实时观察钙化病变的形成过程，旨在识别病理过程中的关键生物学特征。我们的发现揭示了VEC、VIC和基质重塑在病变形成前、中、后的关键事件。我们发现内皮单层裂解和聚集以及随之发生的VIC和ECM团块是钙化病变的生物标志物，而纤维化重塑与病变形成相关但并非必要条件。在通过实时成像确定病变形成的关键生物标志物后，我们评估了整体组织压缩（作为纤维化的指标）与病变形成之间的关系。接着，我们研究了RhoA和Rac1 GTP酶通路在病变形成样本中的活性。

实验细节

猪主动脉瓣细胞培养及细胞分离

猪主动脉瓣内皮细胞（VEC）和间质细胞（VIC）的分离方法如前所述[24,39]。实验前，猪VIC细胞在含有DMEM+10% FBS+1x P/S的培养基中培养，细胞密度约为50-75%。猪VEC细胞还培养在涂有50ug/mL鼠尾I型胶原蛋白（Enzo，纽约长岛；IBIDI，威斯康星州菲奇堡）的组织培养瓶中，同时加入50 U/mL肝素（VWR，宾夕法尼亚州拉德诺）。

骨形成条件下内皮单层的快速剥离和聚集现象

我们利用慢病毒转染技术创建了GFP标记的猪主动脉瓣内皮细胞系，用于在3D VIC+VEC共培养系统中实时追踪内皮细胞（见图1（顶部），补充图S1 A-E）。从培养第3天到第7天，每天对CTRL组和OGM处理组的相同位置进行实时成像（见图1（中间）。在整个培养期间，对照组的内皮层保持均匀，仅有少量细胞丢失。

讨论与结论

本研究的目的是实时识别钙化病变形成过程中VEC、VIC和基质中病理稳态破坏的关键生物学特征。为此，我们开发了一个集成的二维和三维实时成像平台，结合GFP细胞谱系追踪技术，可以每小时或每天进行测量，观察钙化病变的形成过程并识别各细胞类型的贡献。

数据可用性

与本研究相关的数据可应合理要求提供

作者贡献声明

Katherine Driscoll：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、软件开发、方法学设计、实验设计、数据分析、概念化。

Santosh Balakrishnan：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、软件开发、方法学设计、数据分析。

G Janani：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、数据分析。

Hrishika Gogineni：验证、方法学设计。