利用患者来源的异种移植细胞在工程组织模型中重新评估患者间结直肠癌肿瘤的异质性

《Acta Biomaterialia》：Recapitulating Patient-to-Patient Colorectal Cancer Tumor Heterogeneity Using Patient-Derived Xenograft Cells in an Engineered Tissue Model

患者来源异种移植（PDX）3D工程组织构建及结直肠癌异质性建模研究。通过PEG-Fb水凝胶封装不同分期CRC-PDX肿瘤细胞，验证3D-eCRC-PDX组织在长期培养中能保持原PDX肿瘤的细胞亚群比例（人癌/鼠基质细胞比、CK20+细胞比例）、机械刚度和转录组特征，并成功聚类患者特异性基因表达模式。

　　

伊曼·哈萨尼（Iman Hassani）|本杰明·安比亚（Benjamin Anbiah）|袁天（Yuan Tian）|布尔布尔·艾哈迈德（Bulbul Ahmed）|威廉·J·范德波尔（William J. Van Der Pol）|埃利奥特·J·莱夫科维茨（Elliot J. Lefkowitz）|佩顿·库勒斯（Peyton Kuhlers）|妮可·L·哈比特（Nicole L. Habbit）|马丁·J·赫斯林（Martin J. Heslin）|迈克尔·W·格林（Michael W. Greene）|伊丽莎白·A·利普克（Elizabeth A. Lipke）

美国阿拉巴马州奥本大学化学工程系，邮编36849

摘要

建立能够更准确地模拟患者肿瘤微环境异质性的体外癌症模型至关重要，这些异质性包括影响结直肠癌（CRC）进展的基质细胞变化和机械特性。本研究评估了3D工程化CRC-PDX（3D-eCRC-PDX）组织模拟三名CRC患者（II期、III-B期和IV期）来源的异种移植（PDX）肿瘤之间异质性的能力。为了形成3D-eCRC-PDX组织，将CRC-PDX肿瘤细胞封装在PEG-纤维蛋白原水凝胶中，并在体外培养29天。3D-eCRC-PDX组织再现了关键的患者特异性肿瘤特征。在长期培养过程中，3D-eCRC-PDX组织模拟了原始CRC-PDX肿瘤的患者特异性生长速率。重要的是，肿瘤细胞亚群（包括人类癌细胞与小鼠基质细胞的比例以及增殖型人类癌细胞与CK20⁺细胞的比例）在3D-eCRC-PDX组织中得到了保持，而在2D细胞培养中则无法实现这一点。原始CRC-PDX肿瘤之间的机械硬度差异也得到了3D-eCRC-PDX组织的再现。转录组数据的主成分分析将3D-eCRC-PDX组织与CRC-PDX肿瘤按患者进行了聚类，表明它们具有相似的基因表达谱型。这些发现突显了3D-eCRC-PDX组织作为CRC研究的有力工具的潜力，能够维持患者特异性肿瘤微环境的异质性。

重要性声明

本研究利用PEG-纤维蛋白原和患者来源的异种移植（PDX）肿瘤细胞建立了工程化的结直肠癌组织，用于模拟患者间肿瘤的异质性。能够保留患者肿瘤生物学和结构异质性的体外模型对于开发更具预测性和可重复性的临床前癌症模型至关重要。本研究中，工程化组织复制了患者特异性的肿瘤生长动态，维持了关键的癌症和基质细胞亚群，再现了原始PDX肿瘤的硬度，并保持了患者特异性的基因表达模式。这项工作展示了从患者异种移植中培养细胞的长期可行性，从而能够在体外持续保存关键的肿瘤微环境特征。

引言

在美国，结直肠癌（CRC）是第四大常见恶性肿瘤，导致第二高的癌症相关死亡率[1,2]。为了理解CRC的生物学机制并解决相关研究问题，需要开发能够更好地模拟肿瘤异质性的癌症模型。尽管通过建模已经取得了重要进展，但目前大多数体外模型仍依赖于标准细胞系[[3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]]。由于细胞系通常仅包含一种细胞亚群，并且在建立过程中是选择性分离的，因此它们缺乏患者肿瘤中观察到的广泛异质性[11,12]。为了解决这一缺陷，可以在免疫缺陷小鼠中培养患者来源的细胞，这被称为患者来源的异种移植（PDX）。

与标准细胞系相比，PDX模型更准确地再现了患者肿瘤的异质性[11,14]。证据表明，在免疫缺陷小鼠中培养的PDX肿瘤通常保留了相应患者肿瘤的分子特征、转录组特征和基因改变[[15], [16], [17]]。虽然这些PDX模型是研究肿瘤生物学的有用工具，但使用PDX模型涉及大量的动物处理，从而导致成本高昂、耗时且通量较低[[18], [19], [20]]。为了解决这些限制，一些研究小组尝试在体外2D模型中培养PDX细胞[21,22]。然而，将PDX细胞转化为2D单层培养会改变细胞类型的平衡，最终得到的体外癌症模型无法复制体内存在的复杂细胞亚群[21,22]。其他研究小组则在体外3D CRC球状体或类器官模型中使用了患者来源的细胞[[23], [24], [25], [26], [27], [28]]。尽管这些研究推进了模型的发展，但所得系统往往只能保留PDX肿瘤中部分细胞亚型。特别是包含基质细胞[29]，能够更好地反映亲本组织的复杂异质性。此外，类器官和自聚集球状体模型在模拟或调节肿瘤微环境（TME）硬度方面的能力有限，而TME硬度与疾病进展和生存率相关，因此被认为是建模TME的关键方面。

CRC的组织工程能够支持肿瘤异质性，并通过提供更符合天然肿瘤微环境的生物力学结构，比传统2D模型更准确地模拟患者肿瘤[[23], [24], [25],[30], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39]]。已经开发了基于生物材料的3D模型用于CRC建模。天然聚合物系统如透明质酸-明胶水凝胶已被证明可以支持CRC类器官-成纤维细胞共培养[40]，而基于壳聚糖的冷冻凝胶已被用于证明支架硬度可以调节肿瘤形态[41]。在我们之前的工作中，我们使用天然-合成混合材料聚乙二醇-纤维蛋白原（PEG-Fb）制备了高密度（最初为2000万细胞/立方厘米）的工程化CRC组织，并在长期培养过程中再现了CRC细胞系依赖的表型差异[38]。还建立了其他方法，包括脱细胞ECM以保留天然生化信号[42,43]、3D生物打印以制造调节细胞信号的复合水凝胶[44]、结合基质的微流控肿瘤芯片系统[45,46]以及包含基质细胞的异质共培养平台[47]，以反映肿瘤微环境的复杂性。然而，大多数基于生物材料的3D CRC模型使用的是已建立的细胞系而非患者来源的细胞，这限制了它们模拟患者间肿瘤异质性的能力。此外，许多系统专注于短期培养（7-14天），这适合药物筛选，但不足以研究长期肿瘤行为。

为了更准确地复制患者肿瘤微环境，已将患者来源的细胞和仿生材料（如水凝胶）结合起来，创建了用于多种癌症的体外3D组织工程模型，包括前列腺[33,48]、乳腺[49,50]和胶质母细胞瘤组织[[34], [35], [36]]。在这些研究中，3D支架和患者来源细胞的协同使用增强了天然肿瘤微环境线索的再现，在某些情况下延长了体外 PDX细胞的维持和增殖时间。在我们之前的工作中，我们使用PEG-Fb和CRC PDX肿瘤来源的细胞建立了工程化CRC组织，并用单一CRC PDX系证明了概念的可行性[51]。然而，尚不清楚组织工程构造是否能在延长的体外培养过程中保持患者间肿瘤的异质性，尤其是在结直肠癌（CRC）的背景下。

为了解决这一重要问题，本研究使用了来自II期、III-B期和IV期CRC患者的三条PDX肿瘤系，通过将PDX肿瘤细胞封装在PEG-Fb水凝胶中来生成工程化PDX癌症组织。基于我们之前对一条PDX系的工作，我们评估了这一仿生平台捕捉原始PDX肿瘤患者间异质性的有效性。为了评估相对生长速率的再现，量化了3D工程化CRC PDX（3D-eCRC-PDX）组织中CRC PDX细胞菌落大小和细胞数量在长期培养过程中的变化，并与原始CRC-PDX肿瘤的大小变化进行了比较。为了评估亲本肿瘤细胞组成的维持情况，在整个长期（29天）体外培养过程中评估了3D-eCRC-PDX组织和2D-CRC-PDX细胞培养中的细胞亚群。为了评估3D-eCRC-PDX组织重建原始CRC-PDX肿瘤不同生物力学微环境的能力，随时间评估了3D-eCRC-PDX组织机械硬度的细胞系依赖性变化。为了评估分子保真度，对3D-eCRC-PDX组织和CRC-PDX肿瘤进行了转录组分析，并进行了CMS分类。除了比较3D-eCRC-PDX组织和2D-CRC-PDX细胞培养再现原始CRC-PDX肿瘤系间差异的能力外，还评估了每条系生成的3D-eCRC-PDX组织批次间的重复性。重要的是，我们的结果表明，3D-eCRC-PDX组织忠实地再现了亲本CRC-PDX肿瘤的关键特征——包括生长动态、细胞亚群比例、机械特性和转录组谱型——支持了它们模拟患者间肿瘤变异性的潜力。

部分摘录

PEG-Fb水凝胶的制备

按照既定程序[52,53]合成聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA），随后如前所述[54]将纤维蛋白原连接到PEG上。通过检查PEG化效率和其通过光交联形成3D水凝胶的能力来表征PEG-Fb构造。

CRC PDX细胞的体内扩增

所有动物实验均得到了奥本大学动物护理和使用委员会的批准。使用的II期、III-B期和IV期CRC腺癌PDX系

从CRC-PDX肿瘤中分离出的活细胞数量取决于患者系

我们之前建立了一个组织工程平台，用于在培养中维持CRC-PDX细胞[37]。在这里，我们使用该组织工程平台，利用来自II期、III-B期和IV期患者肿瘤的三个CRC PDX系来研究结肠癌患者间的异质性（图1）。首先确定了三个不同PDX系的活细胞数量，发现从CRC-PDX肿瘤中分离出的活细胞数量取决于患者PDX系（补充图1）。CRC-PDX肿瘤

讨论

为了理解肿瘤生物学并研究疾病机制，需要体外 CRC模型，这些模型能够高度模拟患者的肿瘤。然而，当前的体外模型未能再现患者间的变异性以及肿瘤微环境在肿瘤硬度和基质/成纤维细胞整合方面的异质性。PDX肿瘤作为一种体内模型，能够维持亲本肿瘤的异质性[11,[14], [15], [16], [17]]；然而，使用PDX

结论

在这项研究中，我们使用了来自II期、III-B期和IV期CRC患者的三条PDX肿瘤系，将它们封装在PEG-Fb中，以考察由此产生的工程化CRC-PDX组织在多大程度上能够再现原始PDX肿瘤之间的变异性。对于所有CRC阶段，我们证明了3D工程化CRC PDX（3D-eCRC-PDX）组织中CRC PDX细胞菌落大小和细胞数量的变化率随时间的变化模仿了原始肿瘤的生长速率

缩写

3D-eCRC-PDX：3D工程化结直肠癌患者来源的异种移植

AURIC：奥本大学癌症研究计划

B2M：β-2微球蛋白

CK20：角蛋白20

CMS：共识分子亚型

CRC：结直肠癌

DEGs：差异表达基因

DMEM：Dulbecco改良Eagle培养基

FBS：胎牛血清

GO BP：基因本体生物学过程

glutaGRO：GlutaGRO补充剂

GSEA：基因集富集分析

H2Db：MHC I类H-2 Db

IACUC：机构动物护理和使用委员会

作者贡献

概念提出：M.J.H., M.W.G., E.A.L.；方法学：I.H., B. Anbiah, N.L.H., Y.T., B. Ahmed, W.J.V., E.J.L., P.K., M.W.G., E.A.L.；数据收集和正式实验分析：I.H., B. Anbiah, N.L.H., B. Ahmed；正式生物信息学分析：Y.T., W.J.V., E.J.L., M.W.G.；调查：I.H., B. Anbiah, N.L.H., Y.T., B. Ahmed, W.J.V., E.J.L., P.K., M.W.G., E.A.L.；数据管理：I.H., N.L.H., Y.T., M.W.G., E.A.L.；撰写——原始草稿准备：I.H., N.L.H., Y.T., W.J.V.

资金来源

作者感谢奥本大学癌症研究计划（AURIC）种子资助计划（M.W.G., E.A.L.）、AURIC研究生奖学金（I.H., N.L.H.）、国家转化科学促进中心（UL1TR003096-01（M.W.G., E.A.L.）和国家卫生研究院（NIH）以及美国农业部、国家食品和农业研究所（NIFA）的Hatch资助的支持

CRediT作者贡献声明

伊曼·哈萨尼（Iman Hassani）：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、方法学、调查、正式分析、数据管理。本杰明·安比亚（Benjamin Anbiah）：撰写——审阅与编辑、方法学、调查、正式分析。袁天（Yuan Tian）：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、方法学、调查、正式分析、数据管理。布尔布尔·艾哈迈德（Bulbul Ahmed）：撰写——审阅与编辑、调查、正式分析。威廉·J·范德波尔（William J. Van Der Pol）：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿