Ligilactobacillus animalis NP51菌株的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of Ligilactobacillus animalis strain NP51

该研究首次完整测序了益生菌菌株Ligilactobacillus animalis NP51（LANP51），其基因组长度1881.978bp，含1925个注释基因，包括1777个蛋白编码基因。该菌株作为牛肉 cattle养殖中的预屠宰干预策略，可有效抑制E.coli O157:H7等食源性病原体，基因组数据已通过优化测序流程和拼接算法完成。

　　

摘要

我们报告了益生菌菌株Ligilactobacillus animalis NP51的完整基因组序列，该菌株在肉牛产业中被广泛使用。

公告

在最近对Lactobacillus属进行重新分类后，建立了Ligilactobacillus属（1）。因此，先前被命名为Lactobacillus acidophilus NPC 747、后来又命名为Lactobacillus acidophilus NP51的菌株，现在被归类为Ligilactobacillus animalis NP51（LANP51）。LANP51最初是从牛体内分离出来的，由于其具有对抗食源性病原体（包括Escherichia coli O157:H7）的活性，被用于育肥场的采前干预措施（2, 3）。尽管之前已有LANP51的基因组草图上传至GenBank，但尚未发布完整的基因组序列（4）。在这里，我们首次发布了LANP51的完整基因组序列。

LANP51由Chr. Hansen A/S（隶属于Novonesis）提供，并储存在-80°C条件下。冻干后的细胞重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS，Thermo Fisher Scientific，美国）中，并在室温下平衡10分钟。然后将悬浮液接种到25毫升的De Man, Rogosa and Sharpe（MRS；Merck，德国）培养基中，于37°C下有氧培养18–24小时。将培养物划线接种到MRS琼脂板上以验证纯度，并继续在37°C下培养。最后，将单个菌落接种到50毫升的MRS培养基中，37°C下培养24小时。

收集细胞，用PBS清洗后进行离心沉淀。按照Oxford Nanopore Technologies（ONT）推荐的修改方案（5），使用Blood and Cell Culture DNA Kit（Qiagen，德国）提取基因组DNA。随后，采用SPRI磁珠（Beckman Coulter，美国）进行纯化处理，以去除长度小于2 kb的DNA片段（6）。

基因组测序使用MinION Mk1D测序仪和Flongle接头（ONT，英国）进行，具体操作按照制造商的说明进行。未切割的基因组DNA用于文库制备，使用Ligation Sequencing Kit v14（ONT）和NEBNext Companion Module v2进行ONT连接测序（New England Biolabs，美国）。文库被加载到Flongle flow cell R10.4.1上，使用Flongle Sequencing Expansion Kit（ONT）完成。测序过程使用MinKNOW软件v25.03.9（24小时，180 mV），碱基调用使用Dorado v7.8.3软件（7, 8）。读段过滤时采用了最低质量（Q）阈值9。适配子修剪和错误校正使用Dorado的默认参数。

共生成了约101.33万个读段（362.11 Mb），其中87.38万个读段（348.21 Mb）通过了质量过滤，平均读长为6.29 kb。使用EPI2ME软件v1.4.2和wf-bacterial-genomes nextflow工作流程v1.4.2以及Flye v2.9.5进行de novo基因组组装，采用Flye v2.9.5的默认参数进行环化处理，且不进行重新定向（9, 10）。后续使用Medaka 2.0.0软件进行基因组修饰（9）。基因预测和注释使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline v6.10完成（11–13）。

通过FastANI v1.34软件进行平均核苷酸身份（ANI）分析，确认了其分类学身份，结果显示与参考基因组（GenBank登录号CP047141.1）的ANI为99.14%（14）。最终基因组序列长度为1,881,978 bp，鸟嘌呤-胞嘧啶含量为41.2%，覆盖率为168倍。共注释了1,925个基因，包括1,777个蛋白质编码基因、18个rRNA基因、64个tRNA基因、3个ncRNA基因、62个假基因以及1个CRISPR阵列。

致谢

本工作得到了田纳西大学诺克斯维尔分校农业基因组学中心的支持。