Chicharrita del maíz iflavirus 1的完整基因组序列，该病毒此前是根据玉米叶蝉（Dalbulus maidis）的转录组数据被发现的

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of chicharrita del maíz iflavirus 1, a virus previously identified from transcriptomic data of the corn leafhopper (Dalbulus maidis)

美国首次发现玉米叶蝉（Dalbulus maidis）携带的chicharrita del maiz iflavirus 1（ChMIfV1）病毒基因组，通过RNA测序、PCR和RACE技术完成全基因组解析，揭示其与南美毒株高度同源且属于Iflaviridae科的系统发育关系。

　　

摘要

我们报告了从美国分离出的chicharrita del maiz iflavirus 1的完整基因组，该基因组是通过从玉米叶蝉（Dalbulus maidis）中提取的RNA进行RNAseq、PCR和RACE技术获得的。该基因组编码一种由3,306个氨基酸组成的多聚蛋白，其中包含保守的衣壳结构和复制域，这扩展了人们对半翅目昆虫媒介中iflavirus多样性的认识。

公告

Iflaviridae家族包含小型无包膜病毒，这些病毒可感染节肢动物，并导致从无症状到发育障碍甚至致命的各种后果（1）。2024年9月，我们在美国爱荷华州Story City的两个商业玉米田中使用扫网收集了成年Dalbulus maidis昆虫。这些昆虫被储存在-20°C的70%乙醇中，直至进行形态学鉴定（2）。根据试剂盒说明，使用Synergy 2.0 Plant DNA Extraction kit（OPS Diagnostics）从1到3只完整的昆虫中提取总RNA，但省略了RNase消化步骤。将多个样本的RNA合并成一个复合样本，用于使用TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero H/M/R Gold kit（Illumina）制备互补DNA（cDNA）文库。在Illumina NovaSeqX平台上进行了双端测序（150 bp），产生了约7000万个读段。生物信息学分析按照先前的方法进行（3）。简而言之，经过质量过滤的读段使用rnaviralSPAdes v.4.2.0进行de novo组装（4），并通过NCBI在线BLASTx工具与病毒蛋白数据库进行比对，使用默认参数对病毒 contigs进行了注释。鉴定出一个长度为11,098个核苷酸的contig（覆盖度为110倍），其与来自阿根廷、美国和巴西的D. maidis公共数据集中的chicharrita del maíz iflavirus 1（ChMIfV1，BK068251）的氨基酸同源性超过95%（5）。使用ChMIfV1特异性RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）引物（表1）进行的RT-PCR确认了其存在。为了获得完整基因组，我们使用了重叠扩增子（表1），并结合了cDNA末端的5′和3′快速扩增技术（RACE）。RACE过程使用了由Escherichia coli多聚（A）聚合酶和末端脱氧核苷酸转移酶（New England Biolabs）处理的dsRNA（6）。扩增子通过Sanger和Nanopore测序技术进行了测序（表1）。Nanopore测序由PlasmidSaurus使用无引物v14文库制备试剂在MinION Mk1D设备上完成（Oxford Nanopore Technologies），并使用Guppy（SUP模型）进行碱基调用。Geneious Prime 2025.1.3软件基于参考序列（accession no. BK068251）进行了基因组组装、手动校准和注释，包括预测蛋白质切割位点。ChMIfV1的完整基因组（11,146 nt，PV847825）包含5′和3′非翻译区（UTRs），长度分别为975 nt和250 nt，中间是一个编码3,306个氨基酸的多聚蛋白开放阅读框。保守的蛋白质结构域包括三个衣壳蛋白（aa 324–512、655–722和997–1,148）、一个RNA解旋酶（aa 1,550–1,656）以及一个RdRp结构域（aa 2,952–3,266）。使用NCBI在线BLASTp工具进行的比较显示，该基因组与从公共转录组中组装的ChMIfV1（DBA56841，查询覆盖率100%；同源性98.79%）具有最高相似性，其次是Nephhotettix cincticeps正链RNA病毒-1（UFP63464，查询覆盖率96%；同源性63.44%）。对多个Iflaviridae成员的衣壳蛋白进行的最大似然系统发育分析（图1）将爱荷华州的分离株与先前报道的ChMIfV1分离株（5）以及感染棕色飞虱的Nilaparvata lugens蜜露病毒1（7）归为一类。这个完整基因组为未来研究D. maidis中的病毒多样性和宿主相互作用奠定了基础。

表1

表1 用于验证chicharrita del maiz iflavirus 1（ChMIfV1）基因组及其互补末端快速扩增（RACE）的引物

CCGATGTTGTTGGCTTATCTCTTTTATTTCATTTGAAAATACCCAGTGGTACAATGTATTATTTGAAATGTAATTAGTGCATACGGATATAACCCCTTAAATGCTTTATCTCATTGTTTTTCTATCACATTCTGCCATGGAACTAAGTATTGGGAAAATTTAATTCCTACACAAACTTCAATTTAGAGGCTATTAGAAATATTAGAGAAACAACCGGCGAAGGATATCATCATATTACTACAACTAAATCGGTACTATTTTTGCTACCAAACCAGATCCAAAGAAAAAGTAGCAGTTCACCTGAAACTCCACAGGAGTAGGCGCTGGTATACCGCCCAGCCCTGCATATGAAGG

引物名称	序列（5′至3′）	产物长度（bp）	测序方法a
ChMIfV1_11,218F_3RACE	TGAGGACCAGGATTATGCAGCT	?	ONT
ChMIfV1_464R_5RACE	ACGTTTATTTCAATTCGCCACAAAACC	?	ONT
ChMIfV1_P1_1,924R	TAGCCCACTCCTAAGCCACC	1,492	ONT
ChMIfV1_P1_432F	AGCTTTCATTGTTGGAGATGGTGT
ChMIfV1_P2_1,770F	GGATTGCCGCCCATAAGG	1,217	ONT
ChMIfV1_P2_2,987R
ChMIfV1_P3_2,843F	1,192	ONT
ChMIfV1_P3_4,035R	AATACATAAACATAATCACCATCA
ChMIfV1_P4_3,908F	1,489	ONT
ChMIfV1_P4_5,397R
ChMIfV1_P5_5,258F	1,009	ONT
ChMIfV1_P5_6,267R
ChMIfV1_P6_6,107F	1,437	?
ChMIfV1_P6_7,544R	Sanger
ChMIfV1_P7_7,431F	1,527	ONT
ChMIfV1_P7_8,958R
ChMIfV1_P8_10,371R	1,576	ONT
ChMIfV1_P8_8,795F
ChMIfV1_P9_10,232F	1,112	Sanger
ChMIfV1_P9_11,344R
ChMIfV1_RdRp_F	477	Sanger
ChMIfV1_RdRp_R

^a

每个PCR片段均使用Oxford Nanopore Technology（ONT）通过Plasmidsaurus或爱荷华州立大学DNA设施的Sanger测序技术进行测序。

图1

图1 chicharrita del maiz iflavirus 1（ChMIfV1）的衣壳蛋白（CP）与其在Iflaviridae家族中感染其他节肢动物的同源病毒的氨基酸序列的系统发育关系。使用MUSCLE（8）进行成对序列比对，使用ModelTest NG（9）推断最佳拟合的氨基酸替换模型，并使用MEGA12中的最大似然（氨基酸替换模型LG+I + G4+F）方法构建系统发育树（10）。

致谢

本项目的资金由爱荷华州立大学农业与生命科学学院提供给Alejandro Olmedo-Velarde的启动资金支持。