来自越南的20株环境分离株的伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）混合基因组

《Microbiology Resource Announcements》：Burkholderia pseudomallei hybrid assemblies of 20 environmental isolates from Vietnam

越南庆和省嘲丁 commune 土壤中分离出20株伯克霍尔德菌 pseudomallei 完整高质量基因组，通过Nanopore和Illumina测序联合组装，基因组大小7.02-7.46 Mbp，GC含量68.1%，含6260-6376个蛋白编码基因。MLST分析显示所有菌株遗传 distinct，其中5株亲缘关系密切（<10个基因型差异）。

　　```html

摘要

Burkholderia pseudomallei是一种栖息在土壤中的细菌，可引起类鼻疽，这是一种严重且常常致命的疾病（致死率为10–40%）。在这里，我们报告了来自越南土壤分离株的20个完整的高质量、封闭基因组（大小为7.0–7.5 Mbp，GC含量约为68.1%），这些基因组是通过Oxford Nanopore和Illumina测序数据组装而成的。

公告

Burkholderia pseudomallei在热带和亚热带地区普遍存在，常见于潮湿的土壤和水中。该细菌是类鼻疽的致病菌，这种疾病的死亡率很高（1–4）。常见的感染途径包括通过皮肤接触、吸入和摄入途径。

通过结合Oxford Nanopore和Illumina测序的数据，我们生成了来自越南Nghe An省Quy Hop区Chau Dinh公社的20个农业土壤分离株的完整、高质量基因组，这为现有的基因组资源做出了重要贡献。据我们所知，在本研究之前，只有一个越南的B. pseudomallei基因组被存入数据库。因此，这些基因组对于了解该细菌的区域多样性和进化过程具有宝贵价值。

为了分离细菌，将10克土壤在含有庆大霉素的苏氨酸基础盐溶液（TBSS-C50）中富集4天，温度为40°C。随后，将1毫升样本转移到含有赤藓糖醇作为唯一碳源的9毫升TBSS-C50溶液中，并继续进行培养。然后使用Ashdown琼脂进行传代培养以分离单个菌落，并根据Trinh等人和Novak等人的方法进行TTSS-1 PCR鉴定。

对于DNA提取，从含有5%羊血的Columbia琼脂上挑选每个菌株的1微升菌落进行提取（BD Biosciences；37°C培养24小时）。使用NucleoSpin微生物DNA试剂盒（Macherey-Nagel）进行DNA提取，并进行了少量修改（9），然后用AMPure XP珠子溶液进行纯化（Beckman Coulter）（9）。使用Qubit 4荧光计和Qubit BR试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对DNA进行定量，每次提取可得到约15–20微克的DNA。用于Illumina和Nanopore测序的DNA样本均来自同一个冷冻保存的菌落。

对于Nanopore测序，使用Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)和R10.4.1流式细胞仪（Oxford Nanopore Technologies）进行文库制备，不进行大小筛选。使用Dorado（v0.7.2；模型“dna_r10.4.1_e8.2_400bps_sup@5.0.0”进行碱基调用、解多路复用和接头修剪。使用Nanoplot（v1.44.1）评估读取质量。对于Illumina测序，使用Nextera XT文库制备试剂盒和MiSeq仪器以及MiSeq试剂盒版本2（Illumina, Inc.）进行2 × 100 bp或2 × 150 bp的双端测序，并使用FastQC（v0.12.1）评估读取质量。

使用Autocycler（v0.3.0.）进行长读长组装，设置标准参数（包括Flye [v.2.9.5]、Minasm [v.0.3]、minimap2 [v2.28]、NextDenovo [v.2.5.2]、Raven [v.1.8.3]和NECAT [v.0.0.1_update20200803]）。仅包括具有封闭、环状基因组的菌株。使用Medaka（v1.11.3；模型“r103_min_high_g360”对组装结果进行优化（16）。通过应用Fastp（v0.24.1）、Polypolish（v.6.0）和Pypolca（v.3.1；谨慎模式）对Illumina读取结果进行混合组装（17）。使用Quast（v5.2.0）进行质量评估，并通过NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（PGAP v6.10）进行注释（18）。除非另有说明，否则使用默认参数。

总共组装了20个分离株的基因组，基因组大小范围为7,024,618（Bp14）至7,456,996（Bp27） bp。平均GC含量为68.1%（67.95–68.30%）（表1）。染色体1的平均长度为4.0 Mbp（3,906,615–4,263,701 bp），染色体2的平均长度为3.2 Mbp（3,100,937–3,243,075 bp）。此外，在分离株Bp26中通过MOB-suite（v3.1.9）鉴定出一个132 kbp的质粒（GC含量为61.84%；包含129个基因），该质粒与B. pseudomallei TSV202菌株的质粒1具有最高的相似性（登录号：CP009155.1），查询覆盖率为43%，序列同源性为99.43%。总共鉴定出6,457个基因（6,228–6,737个），其中包括6,260个蛋白质编码基因、77个RNA基因和120个假基因。cgMLST分析（5, 16）显示所有20个分离株在基因上都是不同的，尽管有5个分离株在4,221个目标基因上仅有10个等位基因差异（图1）。

表1

表1 来自越南的20个B. pseudomallei分离株的特征、组装质量和登录号信息^a

₅₀（Nanopore原始读取输入）SAMN43911436SAMN43911438SAMN43911439SAMN43911440SAMN43911441

分离株名称	RefSeq	GC (%)	基因组大小	基因数量	原始读取输入
大小（bp）	contig编号	染色体1大小（bp）	染色体2大小（bp）	质粒大小（bp）	基因总数	蛋白质编码基因数量	RNA基因数量	假基因数量	SRA（Nanopore）	SRA（Illumina）	Nanopore读取次数	Illumina读取次数	N	基因组覆盖率（Nanopore）	基因组覆盖率（Illumina）	BioSample登录号
Bp01	GCF_052858755.1	68.15	7,206,361	2	4,092,017	3,114,344	–	6,431	6,249	76	106	SRR30791284	SRR30791283	253,948	6,551,166	11,826.0	336.3	136.2	SAMN43911426
Bp02	GCF_052858685.1	68.06	7,275,229	2	4,091,997	3,183,232	–	6,544	6,356	77	111	SRR30791272	SRR30791261	156,974	7,038,462	19,468.0	245.3	144.9	SAMN43911427
Bp05	GCF_052858145.1	68.15	7,230,632	2	4,080,232	3,150,400	–	6,469	6,293	77	99	SRR30791203	SRR30791282	167,247	6,578,806	18,381.0	269.0	136.3	SAMN43911430
Bp06	GCF_052857935.1	68.19	7,159,108	2	4,009,207	3,149,901	–	6,370	6,195	77	98	SRR30791281	SRR30791280	385,072	5,886,782	10,345.0	407.4	123.2	SAMN43911431
Bp11	GCF_052857225.1	68.23	7,147,827	2	3,976,171	3,171,656	–	6,425	6,240	78	107	SRR30791268	SRR30791266	363,040	2,999,356	10,701.0	402.8	41.9
Bp13	GCF_052857015.1	68.26	7,072,326	2	3,951,380	3,120,946	–	6,291	6,103	77	111	SRR30791262	SRR30791258	199,585	3,463,130	17,267.0	319.6	48.9
Bp14	GCF_052856205.1	68.30	7,024,618	2	3,906,615	3,118,003	–	6,228	6,042	77	109	SRR30791257	SRR30791255	149,863	2,738,836	20,188.0	272.1	38.9
Bp15	GCF_052855985.1	68.21	7,130,256	2	4,007,637	3,122,619	–	6,386	6,204	77	105	SRR30791254	SRR30791253	192,937	6,789,608	17,805.0	314.5	142.7
Bp16	GCF_052855615.1	68.21	7,131,998	2	4,007,748	3,124,250	–	6,389	6,207	77	105	SRR30791252	SRR30791249	197,647	8,484,816	16,778.0	306.8	178.3
Bp17	GCF_052855605.1	68.19	7,185,644	2	4,038,557	3,147,087	–	6,465	6