从富含尼古丁的活性污泥中分离出的降解尼古丁的假单胞菌（Pseudomonas）和斯图策里蒙纳斯菌（Stutzerimonas）菌株的基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Genome sequences of nicotine-degrading Pseudomonas and Stutzerimonas strains isolated from nicotine-enriched activated sludge

从活性污泥中分离出7株新型尼古丁降解菌，属假单胞菌属和斯图尔蒂蒙斯属。通过连续传代培养及单菌落分离获得，并利用纳米孔测序技术完成全基因组测序。系统发育分析表明，新菌株与已知尼古丁降解菌亲缘关系近，且基因组水平差异显著，同时检测到移动遗传元件的存在。

　　

摘要

我们从活性污泥富集培养物中分离出了七种新型的能够降解尼古丁的Pseudomonas和Stutzerimonas菌株。这些菌株是通过将活性污泥微生物群在含有尼古丁作为唯一碳源的M9最小培养基中连续传代培养后，再通过单菌落分离得到的。

公告

在细菌属（如Pseudomonas和Arthrobacter）中，尼古丁代谢途径已经被广泛研究（1）。为了从污水处理环境中鉴定出更多的尼古丁代谢微生物，我们使用含有微量金属和1 g/L尼古丁作为唯一碳源的液体M9最小培养基对活性污泥群进行了富集培养。活性污泥接种物来自威斯康星州麦迪逊市的Nine Springs污水处理厂，并以5%的浓度接种到M9 + 尼古丁培养基中。培养物在室温下进行，同时以200 rpm的速度持续振荡，并在生长停止后（大约3-4天）进行传代。经过六次连续传代后，将单个样本接种到M9 + 尼古丁琼脂平板上进行单菌落分离。单菌落分离后，使用Oxford Nanopore Technology（ONT）和Plasmidsaurus（美国加州）对每个分离株进行了全基因组测序。

单菌落被接种到3 mL的LB培养基中，在37°C下振荡过夜，然后通过1 mL的DPBS进行沉淀和洗涤，随后重新悬浮在500 μL的Zymo DNA/RNA Shield中。使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus试剂盒提取DNA后送交测序。文库构建采用了v14文库制备试剂，测序在R10.4.1流式细胞仪上进行，未使用引物。

基因组组装由Plasmidsaurus使用以下流程完成：首先使用Filtlong v0.2.1移除了读长的底部5%以去除低质量序列（2），总读长范围为56,000至214,000个碱基对。使用Miniasm v0.3进行初步组装（3），然后使用Flye v2.9.1进行组装（4），该软件针对高质量的ONT读长进行了参数优化；对于原始覆盖度超过100×的样本，将覆盖度降采样至100×。使用Medaka v1.8.0对Flye组装结果进行了优化（5），以提高碱基水平的准确性。使用CheckM v1.2.2评估了基因组的完整性和污染情况（6）。分类鉴定使用GTDB-Tk v2.6.1进行（7）。除非另有说明，所有软件均使用标准参数运行。

我们获得了七种能够降解尼古丁的菌株的基因组序列，所有菌株的基因组大小约为4至4.5 Mb，除了NM20（约为6 Mb）。GC含量范围为62%至63%。读长N50值范围为5至10 kb。随后将这些读长组装成每个包含一个线性连续片段的草图组装。组装覆盖度范围为60×至100×。基因组完整性为99.9%至100%，所有菌株的污染水平均不超过1%。GTDB-Tk（7）分析将NM20归类为Pseudomonas alloputida，其他菌株归类为Stutzerimonas属（表1）。这些基因组含有与其他Pseudomonas物种相似的尼古丁降解操纵子（1）。通过MEGA和dRep进行的系统发育分析（图1）将这些菌株与之前已鉴定的尼古丁降解Pseudomonas菌株进行了比较（8–12）。新分离的菌株在尼古丁降解操纵子方面具有相似性，但在全基因组水平上存在显著差异。此外，还发现了位于尼古丁降解操纵子侧翼的移动元件，这表明可能存在类似于Arthrobacter尼古丁降解簇中的水平基因转移事件（13）。

表1

表1 新型尼古丁降解菌株的基因组特征

菌株	完整性（%）	污染率（%）	长度（bp）	读长N50	GC含量（%）	原始覆盖度（×）	组装覆盖度（×）	注释基因	测序总碱基对数（bp）	总读长	分类	登录号
NM04	100	0.14	4,373,013	5,183	63	117	99.5	4,089	512,208,282	178,604	Stutzerimonas nitrititolerans	SAMN53033551
NM18	100	0.68	4,312,926	9,199	63	64	60.6	4,070	275,919,868	56,500	Stutzerimonas nitrititolerans	SAMN53033552
NM20	99.9	1.02	6,039,682	10,329	62	103	98.1	5,565	626,050,030	109,035	Pseudomonas alloputida	SAMN53033553
NM22	100	0.31	4,284,175	6,737	63	145	99.8	3,983	623,899,169	159,921	Stutzerimonas nitrititolerans	SAMN53033554
NM31	100	0.55	4,499,974	6,405	62	106	99.9	4,273	478,998,232	127,627	Stutzerimonas stutzeri	SAMN53033555
NM33	100	0.27	4,262,259	7,740	63	224	100	3,980	956,031,597	214,229	Stutzerimonas nitrititolerans	SAMN53033556
NM35	100	0.55	4,510,989	7,522	62	61	58.7	4,213	279,443,766	65,020	Stutzeromonas sp.	SAMN53033557

图1

图1 尼古丁降解Stutzerimonas和Pseudomonas菌株的系统发育分析。最大似然（ML）系统发育树显示了新测序的菌株（以粗体显示）与之前已鉴定的尼古丁降解Pseudomonas菌株之间的关系。该树是基于包含nicA2至< />的尼古丁降解操纵子或其同源序列（1,892 bp）构建的。除了HZN6尼古丁降解簇（JN391188.2）外，还使用了参考菌株：S16（GenBank登录号NC_015733）、JY-Q（NZ_CP011525）、JQ581（NZ_CP050951）和TND35（JOJY00000000）。首先使用Muscle（15）在默认参数下进行多序列比对，然后使用MEGA12（14）构建了ML树。接着使用Kimura 2参数、伽马分布模型和95%的位点覆盖度部分删除以及最近邻交换方法构建了树。数字表示分支长度，刻度条显示每100个位点有5个替换。百分比表示整个基因组的平均核苷酸同一性（ANI），计算方法使用dRep，主要聚类阈值为0.95，次要聚类阈值为0.99（16）。所有成对的ANI都进行了计算，显示百分比大于95%的结果。由于HZN6仅包含尼古丁降解簇而非整个基因组，因此未计算其ANI。

致谢

本研究得到了霍华德·休斯医学研究所的资助。

本研究部分依赖于密歇根大学安娜堡分校高级研究计算部门提供的计算资源和服务。