从台湾采集的花生（Arachis hypogaea）品种“台南优选9号”（Tainan Select No. 9）根瘤中分离出的三种慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）菌株的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequences of three Bradyrhizobium strains isolated from root nodules of peanut (Arachis hypogaea) cultivar Tainan Select No. 9 collected in Taiwan

本研究测序了台湾地区花生品种Tainan Select No. 9的三株根瘤菌Bradyrhizobium基因组，通过Nanopore和Illumina测序平台混合组装，获得高质量基因组数据，为后续研究提供资源。

　　

摘要

我们报告了从台湾采集的花生品种“台南选9号”（Tainan Select No. 9）根瘤中分离出的三种慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）菌株的完整基因组序列。利用Nanopore和Illumina测序数据进行的混合组装产生了环状染色体和质粒的contigs，为未来的研究提供了高质量的基因组资源。

公告

与花生相关的慢生根瘤菌菌株参与根瘤形成和固氮作用，从而支持其植物宿主的生长（1）。为了促进生物资源的发展，我们报告了从台湾采集的花生根瘤中分离出的三种慢生根瘤菌菌株的完整基因组序列。

工作流程遵循了先前的研究（2, 3），试剂盒的使用遵循制造商的说明，生物信息学工具也使用默认设置。这些菌株之前已被分离出来（4）。简要来说，花生品种“台南选9号”（TNS9）于2015年6月在台湾国立大学（25.0153°N 121.5406°E）采集。将单个植株的新鲜根瘤用70%乙醇和2%次氯酸钠表面消毒5分钟，然后用无菌水冲洗三次并压碎。将分泌物涂布在实验室制备的酵母提取物甘露醇（YEM）琼脂平板上（5），并在黑暗中30°C下培养5天。单个菌落至少在新鲜的YEM琼脂平板上重新涂布三次，并储存在-80°C的甘油库中。

这些菌株通过在相同的培养条件下在YEM琼脂平板上划线进行复苏。单个菌落在5 mL的YEM肉汤中于30°C下培养5-6天，直至OD₆₀₀达到1。细胞通过4°C下16,000 × g离心1分钟进行收集，然后使用Nanobind CBB试剂盒（102-301-900；PacBio）进行DNA提取。相同的DNA样本用于两种测序平台。对于Oxford Nanopore Technologies（ONT）测序，样本使用ONT Ligation Sequencing Kit（SQK-NBD114-96）处理，不进行剪切或大小选择，并在MinION（FLO-MIN114）上进行测序。碱基调用使用Dorado v7.6.8软件以超高准确度模式进行，最小q-分数为10。对于Illumina测序，样本使用NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit（New England Biolabs）处理，并在NovaSeq X Plus上使用NovaSeq X Series 25B Reagent Kit（300个循环）进行测序，以获得150 bp的双端读取。

对于混合从头组装，长度超过1,000 bp的ONT读取与使用Trimmomatic v0.39（6）修剪的Illumina读取结合，并使用Trycycler v0.5.5（7）进行组装。为了验证，ONT和Illumina读取分别使用Minimap2 v2.15-r905（8）和BWA v0.7.17-r1188（9）映射到contigs上。使用SAMtools v1.9（10）检查映射结果以评估测序深度。对于每个菌株，Trycycler直接组装了两个对应于染色体和质粒的大环状contigs。基因组完整性进一步通过CheckM2 v1.1.0（11）得到支持，该软件估计完整性为100%，污染率为<3%。为了鉴定物种，使用FastANI v1.33（13）将组装结果与NCBI RefSeq数据库中的参考基因组进行比较（12）。为了鉴定染色体上的dnaA和质粒上的repA，使用参考基因组的蛋白质序列作为TBLASTN v2.11.0（14）的查询。将环状contigs旋转，使这些基因为第一个基因。组装结果提交到GenBank，并使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline v6.10（15）进行注释。关键信息总结在表1中。

表1

表1 三种菌株的基因组组装统计信息^a

菌株	T-1	T-2	T-6
物种归属	慢生根瘤菌属	广东慢生根瘤菌	广东慢生根瘤菌
参考组装和菌株	GCF_018130615.1 (SZCCT0344)	GCF_004114975.1 (CCBAU 51649T)	GCF_004114975.1 (CCBAU 51649T)
比对分数（%）	78.6	94.3	95.1
平均核苷酸同一性（%）	99.0	98.3	98.2
Nanopore读取访问号；读取数量；N50；组合长度；测序深度	SRR36097091; 52,101; 33,463 bp; 1,055,045,192 bp; 113.6×	SRR36097093; 69,275; 28,531 bp; 1,230,550,786 bp; 149.8×	SRR36097395; 51,749; 34,633 bp; 1,065,645,335 bp; 133.1×
Illumina读取访问号；读取数量；组合长度；测序深度	SRR36097092; 41,345,002; 6,243,095,302 bp; 514.6×	SRR36097094; 35,823,830; 5,409,398,330 bp; 600.9×	SRR36097396; 38,045,748; 5,744,907,948 bp; 576.4×
组装访问号	GCA_053592855.1	GCA_053669695.1	GCA_053669755.1
染色体大小（bp）	8,237,534	7,173,377	6,972,587
染色体GC含量（%）	63.5	63.8	63.9
质粒大小（bp）	981,918	979,288	979,288
质粒GC含量（%）	59.3	59.3	59.3
注释基因的总数	8,802	7,818	7,660
完整蛋白质编码序列的数量	8,509	7,514	7,377
假基因的数量	235	250	229
完整的rRNA基因数量（5S, 16S, 23S）	1, 1, 1	1, 1, 1	1, 1, 1
组装完整性和污染估计（%）	100.0, 1.25	100.0, 0.46	100.0, 2.62

^a

物种归属是根据与指定参考基因组的>95% ANI标准确定的。

致谢

我们感谢Hsin-Yi Chang、Shu-Jen Chou和Ai-Ping Chen提供的技术支持。文库制备和Oxford Nanopore Technologies测序服务由台湾中央研究院植物与微生物生物学研究所的基因组技术核心团队提供。Illumina测序服务由Genomics BioSci and Tech Co., Ltd（新北市，台湾）提供。

本工作得到了中央研究院的支持。资助方在研究设计、数据收集与解释或决定发表该工作方面没有发挥作用。