PfAgo介导了一种基于重组酶辅助扩增的快速、可视化检测方法，用于检测猪圆环病毒3型

《Analytica Chimica Acta》：PfAgo-mediated a rapid and visual detection assay for porcine circovirus type 3 based on recombinase-aided amplification

本研究开发了一种结合重组酶扩增（RAA）与Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）的封闭管两阶段检测方法，快速灵敏检测猪圆环病毒3型（PCV3），特异性高且无交叉反应，并通过半定量阈值分类策略实现可靠判读，验证了该方法与现有qPCR检测的一致性。

　　

陈希蒙|张嘉琪|崔洪波|郑兰兰|丁雪艳|陈红英|马世杰

河南农业大学兽医学院，中国郑州市郑东新区龙子湖15号，邮编450046

摘要：

背景

猪圆环病毒3型（PCV3）在猪群中广泛存在，并与多种临床表现相关。其广泛的组织嗜性和多样的临床表现给快速可靠的诊断带来了挑战，尤其是在野外或资源有限的条件下。

结果

本文报道了一种快速核酸检测方法，该方法结合了重组酶辅助扩增（RAA）技术和Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）蛋白来检测PCV3。这种密封管式、两阶段的RAA-PfAgo检测方法针对ORF2基因中的一个高度保守的41 bp区域，在35分钟内完成扩增和检测。该方法能够检测到每微升1个拷贝的PCV3，具有高特异性且不会与其他猪病原体发生交叉反应。为了提高结果的可解释性，引入了一种基于半定量截断值的分类策略，该策略借鉴了ELISA分析的方法，能够在不同的背景条件下区分阳性样本和阴性样本。使用107个临床样本进行的评估显示，该方法与参考TaqMan qPCR检测结果完全一致。

意义

通过将等温扩增与可编程核酸酶介导的信号生成以及以可解释性为导向的分析框架相结合，所提出的RAA–PfAgo检测方法为PCV3的检测提供了一个快速、灵敏且仪器适应性强的平台。这项研究展示了基于PfAgo的诊断技术在实际临床和现场应用中的潜力，而不仅仅是证明概念的敏感性测试。

引言

猪圆环病毒（PCVs）是一种小型无包膜、二十面体结构的病毒，具有约2000个核苷酸（nt）的单链环状DNA基因组，属于Circovirus属，Circoviridae科。迄今为止，根据发现顺序，已在猪体内鉴定出四种PCV物种——PCV1 [2]、PCV2 [3, 4, 5, 6]、PCV3 [7, 8]，以及最近的PCV4 [9, 10, 11, 12, 13, 14]。PCV3最早于2016年由美国两个独立研究小组发现，分别与繁殖失败、猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、心脏炎症及多器官炎症相关 [7, 15]。后续研究表明，PCV3可以感染健康和患病的猪 [16, 17, 18]，并且可以在多种组织和体液中检测到，包括大脑、肾脏、心脏、脾脏、血清、口腔和鼻腔分泌物、粪便、初乳和精液 [19]。系统发育分析表明，PCV3在进化上与其他PCVs不同，可能起源于蝙蝠圆环病毒，之后才适应了猪和其他动物宿主，这引发了关于跨物种传播的担忧 [19]。目前，基于实地调查和回顾性研究，在包括中国、巴西、韩国、日本、泰国和一些欧洲国家在内的地区都报道了PCV3的存在 [7, 20, 21, 22]。此外，在PCV3阳性猪心脏异种移植后，在狒狒受体中检测到PCV3的复制，这突显了潜在的人畜共患病风险，强调了需要可靠的诊断工具 [23]。因此，开发快速且高灵敏度的PCV3检测技术对于有效诊断和监测至关重要。

RAA是一种等温核酸扩增技术，源自重组酶聚合酶扩增（RPA）。RAA的引物-探针配置和作用机制与RPA相同，不同之处在于RPA中使用的是噬菌体T4 GP32，而中国RAA系统中使用的是大肠杆菌SSB [24, 25, 26]。RPA/RAA反应利用三种核心酶：重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和DNA聚合酶。重组酶识别目标序列，SSB稳定反应，DNA聚合酶扩增特定的DNA片段 [27]。RAA的特点是简化了引物设计过程（只需要一对引物）、反应速度快、操作温度低以及仪器要求低 [28, 29, 30]。然而，当单独使用时，RAA可能会产生非特异性扩增产物，包括引物二聚体的形成 [31] 和假阳性信号 [32]。为了克服这些限制，一些研究采用了额外的特异性增强策略，如CRISPR/Cas系统或基于Argonaute的检测平台 [33, 34]。

为了进一步提高检测的特异性，Argonaute（Ago）蛋白最近作为可编程核酸酶被用于序列特异性核酸检测 [35]。Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）是一种DNA引导的内切酶，利用短的5′-磷酸化单链DNA引导物（gDNAs）来指导对互补核酸目标的序列特异性识别和切割 [36]。由于其可编程性、没有严格的原间隔区邻接基序限制以及耐高温性，PfAgo已被整合到多种扩增策略中 [37]，包括PCR、RAA、RPA和环介导的等温扩增（LAMP），用于检测多种病原体，如支原体 [38]、病毒 [39, 40, 41, 42] 和细菌 [37, 43]。

尽管取得了这些进展，但大多数基于PfAgo的诊断平台主要关注分析灵敏度或检测速度，而结果解释仍然很大程度上依赖于绝对荧光强度或实时信号曲线。这种读数方法在接近检测限时容易受到信号波动和歧义的影响，特别是在临床或野外应用中遇到的多变背景条件下。

因此，仍需要开发出不仅具有高分析灵敏度，还能提供稳健、可解释的决策标准的基于PfAgo的诊断方法。在本研究中，我们报道了PfAgo的原核表达和纯化，并建立了一种密封管式、两阶段的RAA–PfAgo检测方法用于PCV3的检测。除了构建检测方法外，我们还系统评估了多种读数模式，包括实时荧光监测、蓝光下的终点视觉荧光检测，以及一种基于半定量截断值的分类策略，该策略借鉴了ELISA分析的方法。通过强调分析可解释性、稳健性和操作者独立性，这项工作旨在弥合基于可编程核酸酶的信号生成与可靠诊断实施之间的差距。

部分片段

引物、5′-磷酸化gDNA和探针设计

本研究中使用的PCR引物、RAA引物、5′-磷酸化gDNA和探针由Sangon Biotech（上海，中国）合成（表S1）。基于PCV3菌株PCV3/CN/Chongqing-147/2016（Genbank编号：KY075990），设计了一对特异性引物PCV3-F/R用于PCR扩增完整的Cap基因（645 bp）。在对25个PCV3菌株的Cap基因序列进行比对后，根据RAA引物设计指南制备了三对潜在的RAA引物。

结果与讨论

猪圆环病毒3型（PCV3）已在全球多个地理区域的家猪和野猪群体中被发现 [7, 8, 20, 21, 22, 45]。越来越多的证据表明，PCV3感染与动物年龄、性别或明显的临床状态关系不大，而是受到环境因素和宿主条件的影响，这些因素促进了病毒的持续存在和传播 [46]。这一流行病学特征使得临床诊断变得复杂。

结论

在这项研究中，我们开发了一种密封管式、两阶段的核酸检测平台，该平台结合了RAA和PfAgo介导的切割技术，用于快速检测PCV3。RAA-PfAgo检测方法在35分钟内提供可视觉解释的结果，并能检测到每反应1个拷贝的PCV3，且不会与其他猪相关病原体发生交叉反应。所有测试的临床样本与参考TaqMan qPCR检测结果完全一致。

除分析方面

CRediT作者贡献声明

陈希蒙：撰写——原始草稿、可视化、验证、软件、方法学、概念构思。张嘉琪：可视化、方法学、概念构思。马世杰：撰写——审阅与编辑。崔洪波：可视化、正式分析、数据管理。郑兰兰：验证、软件、概念构思。丁雪艳：验证。陈红英：撰写——审阅与编辑

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

资金来源

本工作得到了河南农业大学的Young TopNotch Talents Foundation（编号：30501277）和河南开放竞争机制选拔最佳候选人计划（编号：211110111000）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们非常感谢赵宇博士回复我们的邮件并提供了宝贵的建议，同时也感谢傅鹏飞博士对我们工作的认可。