《Analytica Chimica Acta》：Protein-inorganic Hybrid Nanoflowers with Enhanced Laccase-like Activity for Optical Analysis of Urease
冯思诺|王雪娜|李一帆|李佳欣|安晓勇|周波|孙健
中国农业科学院长春兽医研究所，病原生物安全国家重点实验室，吉林省人畜共患病防控重点实验室，长春，130122，中国
摘要：
背景
尿素酶是一种参与尿素水解的关键酶，在环境监测、农业管理和临床诊断中发挥着重要作用。在这些领域中，准确且及时地检测尿素酶活性至关重要。然而，传统的尿素酶活性检测方法通常受到灵敏度不足、操作繁琐或仪器昂贵的限制，这阻碍了它们在快速、现场或实时监测中的应用。鉴于尿素酶在环境和生物分析中的重要作用，开发一种易于使用的检测传感器具有重要意义。
结果
本文介绍了一种基于牛血清白蛋白（BSA）-无机Cu2+杂化纳米花（Cu-BSA HNFs）的特异性和稳定的比色传感器。我们在室温下利用超声波辅助成功合成了具有漆酶样活性的Cu-BSA HNFs纳米酶。令人惊讶的是，尿素酶水解尿素产生的NH3会与Cu-BSA HNFs中的Cu2+中心结合，从而调节活性位点的电子结构，稳定催化循环中的Cu+状态，并加速电子转移速率。这种特异性增强了催化活性，最终导致比色信号的变化。因此，我们基于这种简便的信号响应机制，建立了一种灵敏度为0.054 mU/mL的尿素酶比色分析方法。值得一提的是，我们还制备了一种便携式的纸基Cu-BSA HNFs传感器，可以利用智能手机进行尿素酶的现场定性监测。
意义
本研究利用Cu-BSA HNFs纳米酶构建了一个稳健的比色平台，用于简单且灵敏的尿素酶活性监测，不仅为生物和环境样品中的尿素酶分析提供了一种有效方法，还扩展了纳米酶在即时检测应用中的用途。
引言
随着环境污染问题的日益严重以及精准农业和临床诊断需求的增加，对多种天然酶活性的实时监测系统的需求也在持续增长。(1),(2) 尿素酶是一种在生物系统中广泛存在的关键酶。(3),(4) 它专门催化尿素的水解，产生氨（NH3）和二氧化碳（CO2），(5) 并在全球氮循环中起着重要作用。然而，环境中异常高的尿素酶活性与一系列问题密切相关，例如农业中过量使用尿素肥料导致的氨挥发、水体富营养化和土壤pH值失衡。(6),(7) 此外，某些病原菌（如幽门螺杆菌）的新陈代谢依赖于尿素酶，使其成为重要的生物标志物。(8) 因此，开发快速、灵敏和可靠的尿素酶检测方法对于环境监测、农业生产及医学诊断至关重要。
传统的尿素酶检测方法存在线性范围狭窄（例如酚红指示剂法）、(9) 操作复杂（例如Berthelot测定法）、(10) 使用有害试剂（例如Nessler试剂中的汞盐）、(11) 以及需要专用仪器（例如滴定法)等缺点，这些限制了商业规模传感器的开发。近年来，已经开发出多种尿素酶检测方法，如比色法、(13),(14) 荧光法、(15),(16) 电化学法、(17) 和表面增强拉曼散射法。(19) 尽管这些方法具有优异的灵敏度和选择性，但其实际应用往往受到笨重昂贵专用仪器、专业技术人员以及耗时的限制，不适合在现场环境中使用。因此，开发操作简便、成本低廉、定量且可视化的尿素酶检测方法非常有必要。
纳米酶是人工设计和合成的纳米材料，被认为是天然酶的有希望的替代品。(20),(21) 与天然酶相比，它们具有更高的稳定性、更低的生产成本、更易于修饰以及更好的耐受恶劣条件的能力。(22),(23) 这些优势使它们在生物传感、(24) 医学诊断、(25) 和环境监测等领域具有广泛的应用前景。(26) 在所有纳米酶中，有机-无机杂化纳米花（HNFs）是通过生物成分（如蛋白质、植物提取物、DNA、RNA和某些小分子）中的酰胺基团与金属离子之间的有效配位而形成的(27),(28),(29)，从而形成层次化的花状微结构，赋予其优异的生物相容性和较大的表面积。(30) 此外，HNFs在温和条件下合成，并表现出类似酶的催化活性，能够有效催化显色底物，导致快速且明显的颜色变化。(31) 因此，将HNFs与便携式纸基传感器结合，提供了一种简单、低成本且方便的纳米酶传感平台，适用于生物分子的现场检测，在疾病筛查和污染物监测方面展现出巨大潜力。
在本研究中，我们利用超声波辅助，在室温下成功合成了具有明显漆酶样活性的Cu-BSA HNFs。无色的2,4-二氯酚（2,4-DP）被Cu-BSA HNFs氧化并与4-氨基安替比林（4-AP）形成红色产物，其吸收峰位于510 nm。如图1所示，在尿素酶催化尿素水解产生的氨（NH3存在下，Cu-BSA HNFs纳米酶对显色底物的催化活性得到增强，伴随明显的颜色变化。受此启发，我们开发了一种基于Cu-BSA HNFs的新型比色传感器用于尿素酶活性的评估。此外，通过集成智能手机的RGB值识别功能，使得尿素酶活性的检测变得可视化、直观且准确，证明了所设计的纸基传感器的实用性和适用性。该便携式平台为开发易于操作和低成本的现场传感器提供了可行的工具。
章节片段
Cu-BSA HNFs的制备
Cu-BSA HNFs的制备方法基于已发表的文献略有修改。(32) 通常，将800 μL的CuSO4·5H2O水溶液（120 mM）加入到含有1 mg/mL BSA的120 mL 1×PBS溶液中。然后在室温下对混合物进行不同时间（1、3、5、7和9分钟）的超声波处理。生成的蓝色沉淀物经过离心（10,000 rpm，10分钟）后，用超纯水洗涤3次，最后分散在超纯水中并储存在4 °C。
Cu-BSA HNFs的结构表征
具有漆酶样活性的Cu-BSA HNFs纳米酶是通过简单的超声波处理合成的，如图1A所示。纳米花状Cu-BSA的自组装得益于蛋白质和Cu（II）之间的配位，这归因于蛋白质主链中酰胺基团的丰富氮原子以及氨基酸残基的存在。(32) 使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对其进行了表征。
结论
总之，我们设计了一种基于Cu-BSA HNFs的便携式纸基生物传感平台，用于尿素酶的定量检测。通过超声波驱动的无机Cu2+与BSA自组装策略，合成了稳定性良好且具有显著漆酶样活性的Cu-BSA HNFs。值得注意的是，Cu-BSA HNFs在与尿素酶和尿素反应生成的NH3产物反应后，其漆酶样活性得到增强。这种增强主要归因于...
CRediT作者贡献声明
安晓勇：撰写 – 审稿与编辑。冯思诺：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学研究、数据分析、概念构思。王雪娜：撰写 – 审稿与编辑、数据分析。李一帆：撰写 – 审稿与编辑。李佳欣：撰写 – 审稿与编辑。周波：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金筹集。孙健：监督、资源协调、项目管理
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
本工作得到了吉林省科技发展项目（20250602066RC）的支持。
