《Analytica Chimica Acta》：Click chemistry-based bioconjugates for direct immunochemical analysis of the mycotoxin citrinin
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本研究成功开发基于点击化学的新型单克隆抗体直接竞争ELISA方法，用于快速检测食品中低纳米摩尔级Citrinin。通过设计含氮杂环的hapten底物，解决了传统方法无法直接竞争检测的难题。该方法在质量控制材料和市售发酵红米制品中均取得理想检测效果（回收率95.2%-102.8%，检测限0.5 μg/kg），为欧盟强化监管的Citrinin检测提供了可靠工具。
迪戈·乌洛亚-坎波斯（Diego Ulloa-Campos）|丹尼尔·洛佩兹-普埃尔托亚诺（Daniel López-Puertollano）|安东尼奥·阿巴德-索莫维利亚（Antonio Abad-Somovilla）|何塞·希梅诺-阿尔卡尼兹（José Gimeno-Alca?iz）|约瑟普·V·梅尔卡德（Josep V. Mercader）|安东尼奥·阿巴德-富恩特斯（Antonio Abad-Fuentes）
瓦伦西亚大学有机化学系，Doctor Moliner 50号，Burjassot 46100，瓦伦西亚，西班牙
摘要
背景
在过去的几十年中，已经为所有受监管的霉菌毒素开发了免疫测定方法。这一科学和技术成就显著地影响了人类健康的保护，并极大地促进了食品免疫诊断产业的发展。在这些霉菌毒素中，柠檬霉素（citrinin）尤为重要，尤其是在欧洲对其在食品补充剂中的含量限制变得更加严格之后。商业化的霉菌毒素检测ELISA试剂盒通常使用单克隆抗体结合酶示踪剂。然而，迄今为止，尚未发表基于单克隆抗体的直接竞争性免疫测定方法用于分析柠檬霉素。
结果
为了解决这一空白，我们设计并合成了一种新型的半抗原，该半抗原具有可用于点击化学（click chemistry）偶联的叠氮化物功能化连接基团。值得注意的是，这种半抗原保留了柠檬霉素C-7位置的羧基，分子建模研究证实，所得的功能化衍生物是天然霉菌毒素的出色结构模拟物。利用这一策略，我们制备并表征了一种适用于免疫测定开发的酶示踪剂以及能够产生强烈免疫反应的免疫结合物，并通过MALDI-TOF分析进行了验证。随后，通过涉及抗体包被微孔板的选择过程，产生了一系列亲和值在低纳摩尔范围（2.62 – 18.1 nM）内的小鼠单克隆抗体。成功开发了一种ELISA原型，用于测定质量控制材料中的柠檬霉素含量，其指定值为90.8 μg/kg，以及用紫色毛霉菌（M. purpurea）发酵的八种商业食品样品中的柠檬霉素含量，这些样品中的柠檬霉素浓度范围为4.7至67.6 μg/kg。
意义
本文报道了第一种基于单克隆抗体的柠檬霉素直接测定方法。这一目标的实现得益于将开创性的点击化学酶示踪剂与新生成的抗柠檬霉素单克隆结合剂相结合。经过进一步优化和验证，所得的免疫测定方法将能够灵敏地检测受监管商品中的柠檬霉素，包括含有发酵红米（red rice）的食品补充剂。
引言
食品中存在有毒化学污染物，尤其是那些供儿童食用的食品，是全球消费者和卫生当局关注的重大问题，尤其是在欧盟（Eurobarometer报告，2019年；Eurobarometer报告，2022年）。在这方面，霉菌毒素对食品和饲料的污染已被认为是一种威胁人类和动物健康的全球性风险。据估计，全球60-80%的农作物受到霉菌毒素的影响，而全球变暖预计会改变产生霉菌毒素的真菌的地理分布，可能增加受感染作物的发生率（Eskola等人，2020年）。此外，霉菌毒素还对农业食品行业构成了经济负担，特别是在某些国家（Goda等人，2025年）。因此，许多国家和国际卫生及政府机构针对食品和饲料中最有害的霉菌毒素发布了严格的监管指南。
柠檬霉素[(3R,4S)-8-羟基-3,4,5-三甲基-6-氧代-4,6-二氢-3H-2-苯并吡喃-7-羧酸；CAS编号518-75-2]是一种由Aspergillus、Penicillium和Monascus属多种真菌产生的聚酮类霉菌毒素。这种次级代谢物最初于20世纪30年代在P. citrinum的培养物中被发现。尽管最初因其强大的抗菌特性而受到关注，但其对哺乳动物的毒性作用导致抗生素研究领域的终止（Zhang等人，2021年）。已在主食（如玉米、燕麦、大米、小麦、大麦）和其他植物制品（包括豆类、水果、蔬菜、香草、坚果）甚至变质的乳制品中检测到柠檬霉素污染（EFSA食品链污染物小组，2012年；Huertas-Perez等人，2015年；Silva等人，2021年）。特别值得关注的是，用紫色毛霉菌（Monascus purpureus）发酵的大米是人体接触柠檬霉素的一个来源。由于这种微生物会产生莫纳科尔K（monacolin K），含有红米（red yeast rice）的食品补充剂被宣传为有助于降低胆固醇水平并支持心血管健康。然而，这些产品也可能含有高水平的柠檬霉素，从而对消费者构成潜在的健康风险（López-Sánchez等人，2017年；Tangni等人，2021年）。
柠檬霉素的毒理学特性已被全面记录（Farawahida等人，2022年；Tsai等人，2023年）。2012年，欧洲食品安全局（EFSA）将每日可容忍摄入量的“无肾毒性水平”定为0.2 μg/kg体重。然而，报告还指出，其遗传毒性和致癌性仍不能完全排除（EFSA食品链污染物小组，2012年）。这些研究最终导致欧盟将基于红米食品补充剂中的柠檬霉素最大允许水平降低到100 μg/kg（欧盟法规，2019年）。然而，对于谷物和其他主要食品中的柠檬霉素，仍存在显著的监管空白（Degen等人，2023年）。这种缺乏全面监管的情况，加上某些食品中柠檬霉素浓度的高变异性，突显了进行有效监测的必要性。此外，在人类尿液样本中也检测到了柠檬霉素，其浓度表明存在不可忽视的暴露（Narvaez等人，2021年）。正如EFSA所述，需要更多关于欧洲食品中柠檬霉素存在情况的数据，以及用于食品和饲料中柠檬霉素分析的认证参考材料和明确性能标准。
准确且常规地定量食品中的柠檬霉素对于有效的食品安全管理和风险评估至关重要。目前，包括柠檬霉素在内的霉菌毒素的分析方法主要依赖于超高效液相色谱串联质谱（UHPLC─MS/MS），因为它具有高灵敏度和稳健性（Atapattu & Poole，2020年；Tangni等人，2021年；Ponz-Perello等人，2024年）。尽管这种仪器技术具有优势，但在需要快速、高效分析的常规食品安全实验室中，其快速高通量筛查能力仍存在局限性。在这方面，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）和侧向流动免疫层析测定在内的免疫分析方法因其快速性、简单性、成本效益、高通量能力和现场筛查潜力而被认为是霉菌毒素检测的吸引人的替代方法（Zhou等人，2020年；Wang等人，2022年）。
免疫测定的基本原理依赖于抗体与其目标分析物之间的特异性相互作用。近年来，多个研究小组报告了基于单克隆抗体（mAbs）的柠檬霉素免疫分析方法的开发，这些单克隆抗体是专门从事食品免疫诊断公司的首选免疫试剂（Kong等人，2017年；Yirga等人，2017年；Cheng等人，2018年；Chen等人，2019年；Yang等人，2025年。相关研究的优点总结见表S1）。这些研究的一个共同特点是使用一锅反应来制备免疫结合物。这涉及将柠檬霉素、载体蛋白和交联剂（甲醛、碳二亚胺或1,4-丁二醇二缩水甘油醚）混合，并在22–37°C下孵育24–48小时。因此，柠檬霉素直接与蛋白质结合，而不是使用半抗原（即模仿柠檬霉素并带有功能化连接基团的分子）。先前关于基于mAb的cELISA测试开发的研究的另一个显著特点是，它们都是结合物包被的间接测定方法。换句话说，早期的研究没有涉及mAb包被的直接cELISA的开发，而直接cELISA是商业霉菌毒素ELISA试剂盒中最常见的格式，因为它比间接格式更简单。
基于上述背景，我们假设通过一锅反应进行结合以及缺乏直接竞争性测定方法之间可能存在关联。直接将柠檬霉素与酶（如辣根过氧化物酶（HRP）结合，而不使用连接剂，可能会阻碍酶示踪剂与mAb之间的有效相互作用，从而阻碍直接cELISA测试的开发。因此，合成一种在分子精确位置带有间隔臂的柠檬霉素半抗原将有助于生成高亲和力的mAb并开发直接免疫测定方法。基于这一想法，我们着手修改柠檬霉素结构，引入一个功能化的脂肪族连接基团，以实现这种衍生物与蛋白质和酶的可控、远距离结合，这一目标在科学文献中尚未报道。通过使用基于点击化学的生物结合物，我们旨在生成高亲和力的柠檬霉素mAb，从而开发出一种灵敏的直接cELISA，用于快速分析含有红米食品补充剂中的这种霉菌毒素。
部分摘录
试剂和仪器
本研究使用的一般试剂、程序和设备详见补充材料文件。柠檬霉素购自Fermentek（以色列耶路撒冷）。牛血清白蛋白（BSA，V级分，编号10735094001）购自Roche Applied Science（德国曼海姆）。辣根过氧化物酶（HRP，编号31490，活性：307 U/mg）购自ThermoFisher Scientific（西班牙马德里）。山羊抗兔免疫球蛋白（GAR）购自Rockland Inc.（美国宾夕法尼亚州利默里克，编号611-1102）半抗原设计
在本研究中，我们假设制备带有烃类间隔臂的半抗原将有助于生成高亲和力的单克隆抗体并开发直接柠檬霉素免疫测定方法。基于此，我们设计了一种柠檬霉素衍生物，在柠檬霉素核心的C-5位置的甲基上通过C─C键引入连接基团（图1中的半抗原I）。这种策略保留了柠檬霉素的完整结构和功能基团，同时将其最小化
结论
探索将功能化连接基团连接到低分子量分析物分子结构的新位置可以增进我们对这一领域的理解，并可能导致发现具有增强结合特性的抗体。在本研究中，我们设计了一种新的半抗原，在柠檬霉素霉菌毒素结构中一个未探索的位置引入了叠氮化物功能化的间隔臂（半抗原I）。我们发现，通过柠檬霉素C-5位置的甲基引入连接基团的策略
CRediT作者贡献声明
何塞·希梅诺-阿尔卡尼兹（José Gimeno-Alca?iz）：方法学。约瑟普·梅尔卡德（Josep Mercader）：写作——审稿与编辑，撰写——初稿，资金获取，概念构思。安东尼奥·阿巴德-富恩特斯（Antonio Abad-Fuentes）：写作——审稿与编辑，撰写——初稿，监督，资金获取，概念构思。迪戈·乌洛亚-坎波斯（Diego Ulloa-Campos）：方法学，研究，形式分析。丹尼尔·洛佩兹-普埃尔托亚诺（Daniel López-Puertollano）：方法学，研究，形式分析。安东尼奥·阿巴德-索莫维利亚（Antonio Abad-Somovilla）：写作——审稿与编辑，撰写——初稿，监督，
未引用参考文献
EFSA食品链污染物小组，2012年。数据和材料可用性
数据可应要求提供。本文报告的免疫试剂的有限数量也可应要求提供给作者用于评估。利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：安东尼奥·阿巴德-富恩特斯（Antonio Abad-Fuentes）表示获得了西班牙国家科学研究高级委员会（State Agency Higher Council for Scientific Research）的财务支持。安东尼奥·阿巴德-富恩特斯拥有专利#P202330902，该专利未授予任何人。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本研究报告工作的财务利益或个人关系致谢
本研究由MCIU/AEI/10.13039/501100011033 [授权号 PID2021-125721OB-C21/C22]资助，并由“ERDF A way of making Europe”共同资助。我们还要感谢西班牙政府（MCIN/AEI）向IATA-CSIC颁发的Severo Ochoa卓越中心认证（CEX2021-001189-S/MCIN/AEI/10.13039/501100011033）。D.U.-C.获得了智利国外博士学位奖学金（Beca Chile de Doctorado en el Extranjero），该奖学金由智利国家研究与发展局资助
