来自波多黎各Fraternidad泻湖高盐度底栖微生物垫的宏基因组文库数据集，采用了间接DNA提取方法

本研究在弗拉特纳迪亚盐沼干湿季节采集 ephemeral 微生物膜样本，采用改进间接DNA提取法获得高分子量DNA，通过宏基因组测序分析税务和代谢多样性，发现干季样本在碳代谢、氨基酸合成和膜运输途径上更丰富，雨季样本则在辅因子合成方面显著，揭示环境变化对微生物群落功能的影响。

　　

摘要

微生物垫是一种生物膜结构，反映了早期地球的生态系统。为了研究其微生物多样性，我们采用了一种间接DNA提取方法，从Fraternidad Saltern泻湖的底栖短暂性微生物垫中提取样本，分别采集了雨季和旱季的样本。这种方法能够获得高分子量的DNA，适用于代谢和多样性分析。

公告

微生物垫由多种微生物组成，这些微生物可能类似于地球上最早的生命形式（1–4）。据推测，这些生态系统在地球大气层的氧化过程中发挥了作用，从而促成了依赖氧气的生命形式的出现（5, 6）。分子技术的进步揭示了微生物垫各层及其微生物群落之间的生态位差异，进而发现了新的微生物及其代谢功能（7, 8）。为了评估分类学和代谢多样性，我们采用了间接DNA提取方法，针对Fraternidad Saltern泻湖的短暂性高盐度微生物垫进行了研究，这种方法提高了DNA分子的回收率，便于进行功能性的宏基因组学和代谢分析（9, 10）。

底栖短暂性微生物垫样本采集自波多黎各Cabo Rojo的Fraternidad Saltern泻湖（坐标：17.98?N, 67.21?W），分别是在旱季和雨季采集的（11），样本在室温下运输并储存在4°C条件下。使用改良的间接提取协议提取了高分子量的DNA（12–14）。经过匀浆和洗涤后，将微生物细胞嵌入低熔点琼脂糖中制成插件，在冰上冷却，然后在37°C下用缓冲液（0.01 M Tris、0.05 M NaCl、0.2 M EDTA [pH 8.0]、1% sarkosyl、1% sodium deoxycholate和1 mg/mL lysozyme）处理3小时以实现细胞裂解。随后在55°C下使用蛋白酶K（1 mg/mL）在ESP缓冲液（1% sarkosyl、0.5 M EDTA [pH 8.0]）中处理24小时进行蛋白质消化，最后用PMSF（phenylmethylsulfonyl fluoride；1 mM）在室温下处理2小时以抑制酶活性。通过电泳和电洗脱方法回收分子量超过20 kb的DNA片段（13, 14）。使用NanoDrop（Thermo Scientific NanoDrop Products）对宏基因组DNA进行质量检测（15），纯化的DNA被连接到fosmid载体pCC1FOS上，并通过Epicentre MaxPlax系统包装到lambda噬菌体中，再转染到EPI300-T1R细胞中（16）。DNA还使用QIAGEN Plasmid Miniprep Kit进行纯化、片段化、接头连接，稀释至4.0 nM浓度后，在Illumina MiSeq平台上进行测序（2 × 300 bp的双端读取，30个循环，使用MiSeq Reagent Kit v3 https://www.mrdnalab.com/）。雨季的总克隆数为1,400个，旱季为30,000个。共生成了2,807,462条序列：旱季1,803,636条，雨季1,003,826条。原始读取数据使用BBMap（bbmap.sh）和默认设置（ambig=all）进行过滤，以去除与参考序列（EPI300-T1R宿主基因组和pCC1FOS质粒）匹配的读段（17）（表1）。数据分析采用了国家微生物组数据协作组织（NMDC）的标准宏基因组工作流程（18），包括质量控制（rqcfilter2 on BBTools v38.94）、组装（MetaSPAdes v4.0.0）、基因预测（Prodigal）、分类学分类（Centrifuge v1.0.4），以及基于DRAM代谢层次模型的功能分类（19–27）。生物信息学分析工作于2025年10月完成。

表1

表1总结了Fraternidad泻湖宏基因组数据集在旱季和雨季的注释信息、质量指标及编码DNA序列（CDS）

季节	类别	指标	数值	方法
旱季	注释	CDS数量	1,443	Prodigal v2.6.3
旱季	注释	总CDS长度	4,807,285 bp	Prodigal v2.6.3
旱季	注释	CDS中位数长度	657 bp	Prodigal v2.6.3
旱季	注释	CDS平均长度	799.183 bp	Prodigal v2.6.3
旱季	注释	最短CDS长度	75 bp	Prodigal v2.6.3
旱季	注释	最长CDS长度	9,075 bp	Prodigal v2.6.3
旱季	注释	CDS长度标准差	609.897 bp	Prodigal v2.6.3
旱季	注释	预测特征	6,014	Prodigal v2.6.3
旱季	质量	编码密度	89.42%
旱季	质量	每Mb基因数	1,167.23
旱季	质量	每Mb序列数	253.02
旱季	MAGs	0
旱季	Contig N50长度	83
雨季	注释	CDS数量	13,827	Prodigal v2.6.3
雨季	注释	总CDS长度	19,893,291 bp	Prodigal v2.6.3
雨季	注释	CDS中位数长度	528 bp	Prodigal v2.6.3
雨季	注释	CDS平均长度	666.018 bp	Prodigal v2.6.3
雨季	注释	最短CDS长度	75 bp	Prodigal v2.6.3
雨季	注释	最长CDS长度	13,632 bp	Prodigal v2.6.3
雨季	注释	CDS长度标准差	530.592 bp	Prodigal v2.6.3
雨季	注释	预测特征	29,869	Prodigal v2.6.3
雨季	质量	编码密度	89.71%
雨季	质量	每Mb基因数	1,407.51
雨季	质量	每Mb序列数	591.7
雨季	MAGs	9
雨季	Contig N50长度	1,635

图1分析显示，旱季和雨季的微生物垫中，Streptomyces（13.3%和10.7%）、Pseudomonas（8.7%和10.3%）以及Burkholderia（4.8%和7.0%）属占主导地位。功能分析表明，旱季样本在碳代谢、氨基酸生物合成和膜转运途径方面较为丰富；而雨季样本则主要涉及辅因子生物合成、碳代谢和氨基酸生物合成。尽管组成相似，但季节间的分类学和功能谱的相对丰度可能受到了天气变化的影响。

图1

图1 Fraternidad Saltern泻湖底栖微生物垫在旱季和雨季的分类组成和功能谱。（A）旱季和雨季采集的每个底栖短暂性微生物垫样本中前25个最常见微生物属的相对丰度。（B和C）旱季（B）和雨季（C）从宏基因组数据中鉴定出的前20个KEGG通路。功能注释基于KEGG同源性（KO）分配，通路丰度以总计数的百分比表示。

致谢

本研究得到了美国国家科学基金会（Microbial Observatory项目编号MCB-0455620）和美国农业部（USDA - CSREES 2007-02386-18042）的支持。此外，Luis R. Morales-Valle协助将序列上传到了NCBI数据库。