《Aquaculture》：Construction of a plasmid-based reverse genetics system for the rescue of shrimp infectious covert mortality nodavirus (CMNV) and use in deciphering the role of its B2 protein in regulating its cross-species infectivity
赵振新|薛婷|王金武|肖瑞|张月|孙美玲|张庆莉|郭华荣
中国海洋大学海洋生命科学学院，海洋遗传与育种重点实验室（教育部），青岛266003，中国
摘要
隐蔽性死亡病毒（CMNV）是导致病毒性隐蔽性死亡病（VCMD）的病原体，对虾类养殖产业造成了严重的经济损失和生态影响。本文构建了一种基于质粒的反向遗传系统，通过将CMNV双组分基因组RNA（RNA1和RNA2）的cDNA分别插入昆虫表达质粒pIZ-V5/His中，再将这两个病毒表达质粒共转染到昆虫Sf9细胞中，成功恢复了CMNV的感染性病毒颗粒（rCMNV）。随后利用该系统分析了B2蛋白在调节病毒跨物种感染性中的作用，通过B2基因敲除突变（rCMNVΔB2）进行了实验。透射电子显微镜（TEM）负染色结果显示，rCMNV和rCMNVΔB2病毒颗粒的直径分别为33至45纳米和33至43纳米。实验表明，rCMNV和rCMNVΔB2不仅能感染培养的Metapenaeus ensis虾的血淋巴细胞，还能感染昆虫Sf9细胞以及Epinephelus fuscoguttatus鱼的鳍细胞（EfF），表明这两种病毒具有跨物种感染性。然而，B2蛋白的敲除显著抑制了病毒的跨物种感染性，这可能是由于其在非天然宿主细胞（Sf9和EfF）中具有更强的RNA干扰（RNAi）抑制能力。该系统为CMNV的遗传操作提供了有力的分子工具，有助于我们进一步理解和潜在控制VCMD。
引言
虾是中国及其他许多国家重要的经济养殖物种（Zhang等人，2007；Lee等人，2022）。集约化养殖和水质污染导致虾类疾病频发，尤其是病毒性疾病，给养殖业带来了巨大损失（Páez-Osuna，2001；Lee等人，2022；Yu等人，2022）。病毒性隐蔽性死亡病（VCMD）于2009年首次在中国养殖的太平洋白虾（Litopenaeus vannamei）池塘中被发现（Zhang等人，2014），随后在泰国（Pooljun等人，2016）、越南和厄瓜多尔（Zhang等人，2017）也有报道，显示出该疾病具有全球传播的风险。目前VCMD已导致养殖虾类大量死亡，累计死亡率高达80%–90%。受感染的虾通常隐藏在深水中，表现出肝胰腺坏死、胃部空虚和腹部肌肉变白的症状（Zhang等人，2014）。
2014年，一种新的RNA病毒——隐蔽性死亡病毒（CMNV）被确定为VCMD的致病因子（Zhang等人，2014）。CMNV属于Nodaviridae科和α-nodavirus属，其特征为无包膜的正二十面体结构，TEM负染色病毒颗粒直径约为32.1±5.5纳米（Zhang等人，2014；Wang等人，2021a）。CMNV的基因组由两条正链单链RNA片段RNA1和RNA2组成。RNA1长度为3228 bp，包含两个开放阅读框（ORFs）：一个编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），长度为1043个氨基酸（116.8 kDa）；另一个编码B2蛋白，长度为132个氨基酸（14.2 kDa）；RNA2长度为1448 bp，编码一个437个氨基酸的衣壳蛋白（47.9 kDa）（Xu等人，2020）。目前关于CMNV的研究主要集中在快速早期诊断（Pooljun等人，2016；Li等人，2018；Wang等人，2022）、流行病学调查（Zhang等人，2017）以及宿主范围和宿主库（Liu等人，2018；Wang等人，2021a，Wang等人，2021b；Xu等人，2021）方面。然而，关于病毒侵入细胞、复制、包装和释放的详细致病机制仍不清楚。
尽管CMNV最初是从虾中分离出来的，但很快发现它具有跨物种传播能力（Zhang等人，2014；Liu等人，2018；Wang等人，2021a，Wang等人，2021b；Xu等人，2021）。具体来说，CMNV可以感染多种对虾，包括太平洋白虾（L. vannamei）、中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）、库鲁玛对虾（Penaeus japonicus）（Zhang等人，2014）和黑虎虾（P. monodon）（Zhang等人，2017），以及巨型淡水对虾（Macrobrachium rosenbergii）（Xia等人，2022）。此外，在与CMNV共存的池塘中还检测到了许多其他甲壳类动物（如螃蟹、桡足类、藤壶、轮虫、枝角类和双壳类）以及多种鱼类（包括日本比目鱼Parallichthys olivaceus（Wang等人，2019）、斑马鱼Danio rerio（Wang等人，2021a）、小黄鲷Larimichthys polyactis（Xu等人，2021）和鰕虎鱼Mugilogobius abei（Zhang等人，2018））。我们的先前研究还表明，天然CMNV能够跨物种感染Epinephelus fuscoguttatus鱼的鳍细胞系（EfF）（Xue等人，2025）以及Cherax quadricarinatus小龙虾的体外培养的造血细胞（Zhao等人，2024），引起明显的细胞病变效应（如空泡形成、细胞脱离和死亡）。然而，CMNV跨物种感染的分子机制仍不清楚。
在Nodaviridae科中，B2蛋白是一种由RNA1亚基因组区域编码的小型非结构蛋白，在α-和β-nodaviruses中高度保守。先前的研究表明，B2蛋白能强烈抑制宿主的RNA干扰（RNAi）途径，这是无脊椎动物和许多低等脊椎动物的主要抗病毒防御机制。在α-nodavirus Flock House病毒（FHV）中，B2是首个被发现的通过结合双链RNA（dsRNA）并阻止Dicer切割来抑制RNAi的动物病毒蛋白（Li等人，2002；Chao等人，2005）。结构研究表明，FHV的B2蛋白形成α螺旋二聚体，具有连续的正电荷沟槽以结合dsRNA，从而抑制RNAi（Fenner等人，2006）。同样，Nodamura病毒（NoV）的B2蛋白也能在昆虫和哺乳动物细胞中抑制RNAi（Galiana-Arnoux等人，2006；Aliyari等人，2008）。其他α-nodaviruses，如Black beetle病毒（BBV），也编码具有保守dsRNA结合基序的B2蛋白（Dasmahapatra等人，1986；Johnson和Ball，2001）。在甲壳类动物中，Macrobrachium rosenbergii nodavirus（MrNV）的B2蛋白已被证明可以通过结合dsRNA在虾中抑制RNAi（Hayakijkosol和Owens，2012）。在β-nodaviruses中，如Red-spotted grouper nervous necrosis病毒（RGNNV）的B2蛋白也能结合dsRNA并拮抗鱼类细胞中的RNA沉默，促进病毒RNA积累（Fenner等人，2006）。总体而言，这些研究表明B2蛋白是nodaviruses中保守的RNAi抑制因子，在保护病毒RNA和促进病毒在多种宿主体内的高效复制中起关键作用。此外，有证据表明B2蛋白家族成员可以干扰Dicer蛋白的PAZ结构域（Fenner等人，2006）。这些发现表明，CMNV的B2蛋白可能通过同时结合dsRNA并与宿主Dicer的PAZ结构域相互作用来调节跨物种感染性。目前尚未开发出用于恢复CMNV的反向遗传系统，阻碍了对其B2蛋白在跨物种感染中作用的研究。
基于质粒的反向遗传系统构建涉及将所有病毒基因组RNA的cDNA分别克隆并插入一个或多个表达质粒中，然后通过共转染在包装细胞中产生感染性病毒颗粒（Kobayashi等人，2007；Pachler等人，2010；Oka等人，2014；Katayama等人，2014）。噬菌体Qβ是首个通过基于质粒的反向遗传系统成功恢复的RNA病毒（Taniguchi等人，1978）。此后，病毒的反向遗传系统迅速发展并在病毒学研究中得到广泛应用。在CMNV所属的α-nodavirus属中，已构建了许多病毒反向遗传系统，包括BBV（Dasmahapatra等人，1986）、PaV（Johnson和Ball，2001）、NoV（Dastidar等人，2013）、FHV（Walukiewicz等人，2008）和MrNV（Gangnonngiw等人，2020）。值得注意的是，MrNV的宿主与CMNV的宿主关系最为密切。Gangnonngiw等人（2020）通过将体外转录的病毒基因组RNA转入昆虫Sf9细胞中，成功恢复了具有感染性的MrNV，表明在Sf9细胞中产生具有感染性的CMNV也是可行的。
在本研究中，我们构建了一种基于质粒的反向遗传系统来恢复CMNV，通过构建包含CMNV RNA1或RNA2全长cDNA的两个表达质粒，然后将这两个表达质粒共转染到Sf9细胞中以包装恢复的CMNV病毒颗粒（rCMNV）。此外，利用该系统，我们通过突变B2蛋白基因的起始密码子来干扰其转录，生成了缺乏B2蛋白的rCMNV病毒颗粒（rCMNVΔB2），并分析了B2蛋白在其跨物种感染性中的生物学功能。接下来，在昆虫Sf9细胞和鱼类EfF细胞中测试了rCMNV和rCMNVΔB2的跨物种感染性，以培养的虾血淋巴细胞作为阳性对照。CMNV反向遗传系统的构建将为研究病毒-宿主相互作用和CMNV的致病机制以及开发CMNV介导的基因转移和表达系统提供有力工具。
章节摘录
天然CMNV的分离
天然CMNV是从中国青岛当地一家养虾场采集的受CMNV感染的太平洋白虾（L. vannamei）中纯化的。具体步骤为：将受CMNV感染的虾的肝胰腺和白色肌肉组织在PBS（4.0 g L?1 NaCl、0.1 g L?1 KCl、1.5 g L?1 Na2HPO4·12H2O和0.1 g L?1 KH2PO4、pH 7.2）溶液中匀浆处理，每克组织用2 mL体积的缓冲液，然后在12,000 × g、4°C下离心30分钟。收集含有病毒的上清液。
CMNV全长RNA1和RNA2的克隆
如图3所示，CMNV的全长RNA1和RNA2已成功克隆。具体来说，从受CMNV感染的太平洋白虾（L. vannamei）中提取总RNA，得到了28 S、18 S和5 S的RNA条带，其中18 S的条带含量最高（图3-A）。从受CMNV感染的虾的总cDNA中扩增出了两个重叠的RNA1片段RNA11-1678（碱基1至1678）和RNA11602-3228（碱基1602至3228），以及CMNV的全长RNA2（图
讨论
病毒反向遗传系统是研究病毒的重要工具，为我们提供了操作性技术平台，用于解析和改造病毒功能基因。在本研究中，我们成功建立了基于质粒的CMNV反向遗传系统，并利用它研究了B2蛋白在调节病毒跨物种感染性中的作用。
CRediT作者贡献声明
赵振新：撰写——原始稿件、方法学、实验设计、数据分析、数据管理。
薛婷：撰写——审稿与编辑、资源获取。
王金武：实验设计。
肖瑞：资源获取。
张月：撰写——审稿与编辑。
孙美玲：方法学。
张庆莉：资源获取。
郭华荣：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金申请、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：32273116和32573477）和山东省重点研发计划（资助编号：2023CXGC010710）的支持。我们感谢海洋生物多样性与进化研究所的仪器设备共享平台以及海洋生命科学学院的大型仪器共享平台提供的免费高速离心机（XPN-100）。
