具有嵌入零价铁纳米颗粒的生物功能性热响应明胶–PNIPAm微载体，用于增强人脂肪源性干细胞的扩增和分化

《Biomaterials Advances》：Biofunctional thermoresponsive gelatin–PNIPAm microcarriers with embedded zero-valent iron nanoparticles for enhanced human adipose-derived stem cell expansion and differentiation

本研究开发了一种多功能热敏响应微载体系统（ZVI-GMC），集成PNIPAm-ALA涂层和零价铁纳米颗粒，实现非酶解细胞分离并促进ADSCs增殖及多向分化能力，为自动化干细胞生物制造提供新策略。

　　

Chayaporn Thammaniphit | Pei-Wen Wang | Yan-Wei Wu | Huei-Yu Tsai | Yu-Ting Cheng | Xiang-Ting Lin | Tsung-Yun Wu | Shun-Hao Chuang | Dinh Thi Thuy Van | Hsieh-Chih Tsai | Dar-Bin Shieh

台湾国立科技大学应用科学技术研究生院，台北106

摘要

人类脂肪源性干细胞（ADSCs）由于其多能性和免疫调节能力，在再生医学中具有巨大潜力；然而，高效且可扩展的扩增仍是一个关键瓶颈。传统的微载体培养系统通常依赖酶解法来收集细胞，这可能会损害干细胞的特性、降低细胞活力，并限制工艺的稳定性。本文报道了一种热响应性和磁响应性的微载体平台（ZVI-GMC），该平台以明胶为核心，表面修饰有聚(N-异丙基丙烯酰胺)-烯丙胺（PNIPAm-ALA），并嵌入了零价铁纳米颗粒（ZVI NPs）。

明胶–PNIPAm-ALA杂化界面实现了温度触发的无酶细胞分离，能够在保持ADSCs活力、表型和分化潜能的同时支持其多次传代。ZVI NPs的加入增强了结构稳定性，赋予了磁响应性，便于操作，并促进了细胞在动态培养条件下的增殖。在ZVI-GMC微载体上培养的ADSCs保持了向成骨、成脂和成软骨谱系的强大分化能力，这一点通过Alizarin Red S、Oil Red O和Alcian Blue染色得到了证实。总体而言，这种大分子-纳米颗粒杂化微载体系统为ADSCs的扩增和谱系维持提供了一种可扩展且生物活性的方法。通过将热响应性聚合物、生物功能性大分子基质和磁性纳米结构集成在一个平台上，ZVI-GMC在自动化、封闭式和高通量干细胞生物制造工作流程中具有巨大潜力，成为再生医学应用中下一代微载体的有希望的选择。

引言

近年来，再生医学的进步得益于生物材料、生长介质和组织工程平台的创新[1]。为了实现间充质干细胞（MSCs）的临床潜力，需要可扩展、安全且无异源物质的培养系统，以实现长期扩增并保持其功能完整性。MSCs以其向损伤部位迁移、分化为间充质谱系以及强大的免疫调节作用而闻名[2]。由于其低免疫原性和天然的肿瘤趋向性，MSCs也成为靶向治疗应用的有吸引力的候选者[3]。

除了基于微载体的平台外，还开发了多种材料辅助策略来支持MSCs的扩增和输送。静电纺丝支架具有纤维结构和高孔隙率，能够提供模拟细胞外基质（ECM）的环境，促进MSCs的粘附、增殖和谱系定向。类似地，3D生物打印技术的进步实现了对细胞分布和支架结构的精确空间控制，可以制造复杂的仿生结构用于MSCs的培养和治疗输送。尽管这些基于支架的系统提供了改进的结构和生化信号，但与可扩展性、细胞回收和工艺集成相关的挑战仍然存在，这推动了基于悬浮液的微载体系统的持续发展[4]。

基于微载体的3D培养系统已成为MSCs扩增的可扩展平台，具有高表面积与体积比和可调的微环境[5]、[6]、[7]。多种聚合物已被探索用于微载体和3D培养系统的基质。虽然天然聚合物如海藻酸盐和胶原蛋白因其生物相容性和ECM模拟性而受到青睐，但合成替代品如聚乙二醇（PEG）因其明确的化学性质和机械可调性而受到重视。然而，海藻酸盐的较差细胞粘附性和PEG的缺乏内在生物活性通常需要额外的功能化[8]、[9]。尽管来自I型胶原蛋白的明胶具有优异的生物相容性[10]、[11]，但传统的静态培养方法仍受接触抑制和依赖酶解（例如胰蛋白酶处理）的限制，这可能会损害MSCs的干性和表面受体[12]、[13]。为了克服这些限制，已经开发出了能够非酶促、响应刺激释放细胞的“智能”微载体。我们之前的研究表明，基于聚NIPAm的热响应性共聚物能够高效、非酶促地释放细胞，并优于2D系统[14]、[15]。特别是，聚(N-异丙基丙烯酰胺)-烯丙胺（PNIPAm-ALA）不仅增强了细胞粘附，还提供了用于进一步化学修饰的功能性胺基团[16]。

将基于铁的纳米材料引入微载体中进一步增加了多功能性——不仅可以通过磁场引导操作，还可以引入生物活性[17]。零价铁纳米颗粒（ZVI NPs）表现出氧化还原活性和超顺磁性。研究表明，它们可以通过调节活性氧（ROS）和线粒体脂质过氧化来触发癌细胞的铁死亡，同时保护非恶性细胞[18]、[19]。此外，ZVI NPs还可以影响NRF2信号通路，这是MSCs增殖和分化的一个关键调控途径[20]。

在这里，我们报道了一种基于明胶的多功能微载体系统，其中包含了PNIPAm-ALA和ZVI NPs，称为ZVI-GMC。这些ZVI-GMC在37°C时促进ADSCs的粘附，并由于热响应性相变而在临界溶解温度（LCST）以下实现无酶释放[21]、[22]、[23]。这种结合了磁响应性和热响应性的特性使得该平台非常适合集成到自动化的3D生物加工系统中。进一步的工程优化将使其能够在受控的磁性和温度信号下实现连续、自动化的MSCs扩增[24]。

材料

明胶A型、span? 80、矿物油、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐（EDC）、聚-L-赖氨酸盐酸盐（PLL，分子量：70,000–150,000 Da）、L-抗坏血酸、支链聚乙烯亚胺（b-PEI，分子量：25,000 Da）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）均购自Sigma-Aldrich。偶氮异丁腈（AIBN）（Sigma-Aldrich，98%）、烯丙胺（Sigma-Aldrich 98%）和N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）（Acros，99%）通过分离纯化得到。

ZVI-GMC的形态和膨胀率通过光学显微镜表征

使用光学显微镜评估的ZVI-GMC的形态和表面特征显示，所有配方都保持了直径在200至300 μm之间的球形结构（图1A–E）。最初制备微球时未进行尺寸筛选，以优化ZVI纳米颗粒的嵌入过程。随后，使用200 μm的筛网对微载体进行尺寸筛选，以便进一步进行材料表征和细胞评估。

讨论

在这项研究中，我们开发了一种集成了零价铁-明胶微载体系统（ZVI-GMC），该系统由嵌入ZVI NPs的明胶微载体组成，并涂覆有热敏感的PNIPAm-ALA层。这项工作的创新之处在于将热响应性释放、磁响应性和生物功能性明胶基信号整合到一个微载体平台上，而不是发现新的分子或机制途径。

结论

ZVI-GMC系统是一种用于ADSCs扩增和分化的稳健且生物活性的微载体平台。通过将基于明胶的大分子支架与热响应性PNIPAm-ALA涂层和嵌入的ZVI NPs结合，该系统实现了无酶、温度介导的细胞收集，同时保持了细胞活力、干性标志物（CD90、CD105、CD73）和多能性。我们的发现表明，ZVI的加入改善了微载体的结构和热性能。

缩写

ADSCs
脂肪源性干细胞
MSCs
间充质干细胞
PNIPAm-ALA
聚(N-异丙基丙烯酰胺)-烯丙胺
GMC
明胶微载体
ZVI NPs
零价铁纳米颗粒
ZVI-GMC
嵌入ZVI NPs的明胶微载体
ROS
活性氧
LCST
临界溶解温度
EDC
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐
PLL
聚-L-赖氨酸盐酸盐
PEI
聚乙烯亚胺
抗坏血酸
PBS
磷酸盐缓冲盐水
AIBN
偶氮异丁腈
CPAD

CRediT作者贡献声明

Chayaporn Thammaniphit：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。 Pei-Wen Wang：撰写——审稿与编辑、验证、监督、方法学、研究、数据分析、概念化。 Yan-Wei Wu：可视化、验证、监督。 Huei-Yu Tsai：验证、方法学、研究、数据分析。 Yu-Ting Cheng：验证、方法学、研究。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢台湾国家科学技术委员会国家生物制药核心设施的“生物成像核心设施”提供的技术支持，以及国立成功大学医学院核心研究实验室的支持。本工作得到了台湾国家科学技术委员会（Grant number: NSTC 114-2314-B-006-013, 111-2320-B-006-042-MY3, 113-2218-E-006-024, NSTC 112-2628-B-011-001-MY3）的资助。